(一)β内酰胺酶活性的直接测定

直接测定β内酰胺酶活性的方法有显色法、i酸测定法和碘测定法等3种，l其中常用的为显色法。采用显色头孢菌素(头孢硝噻吩)进行测定。当细菌产生β内酰胺酶时，l可水解头孢硝嚷吩，l造成电子移位而呈现红色。这是一种敏感特异的方法，l也可用于定量测定。酸测定法和碘测定法操作较为繁琐，l也可用于定量测定。

(二)产ESBLs菌株的检测方法

目前检测菌株产生ESBLs的方法都应用头孢菌素类抗生素与β-内酰胺酶抑制剂克拉维酸联合应用，l利用克拉维酸抑制ESBLs，l使产生耐药的菌株被头孢菌素类抗生素抑制，l从而确认所测试的菌株产生ESBLs。具体检测方法有：i

1.CLSI推荐的检测肺炎克雷伯菌、i产酸克雷伯菌和大肠埃希菌中ESBLs的筛选和确证试验。具体方法有纸片扩散法和稀释法(包括琼脂稀释法和肉汤稀释法)。

2.双纸片协同法　按照纸片扩散法操作，l将测试菌涂布在MH琼脂平板上，l将含克拉维酸(CLA)的阿奠西林纸片贴在平板中央，l然后在距离其周围15～20mm(纸片边缘到边缘)处分别贴上CAZ、iCTX、iAZT纸片，l与含CLA的阿莫西林纸片，l放置35℃18小时，l两纸片间出现协同抑菌区域现象为产ESBLs菌株。在检测大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌时用CTX和AZT较CAZ易于观察结果，l产ESBLs的阴沟肠杆菌用CAZ优于CTX。最好同时使用CAZ和CTX以利于提高检出率。

3.E-test法按照标准纸片扩散法操作，l贴上CAZ／CAZ+CLA，lCTX／CTX+CLA等用于检测ESBLs的E-试验纸条，l放置35℃18小时。结果判断：i加CLA的MIC值比不加CLA的MIC值降低3倍以上，l判断为产ESBLs菌株。

4.自动化仪器法　有多种自动化仪器可以检测产生ESBLs菌株。

5.三维试验　在药敏试验平板上涂布指示菌株，l贴敏感的头孢菌素类抗生素纸片，l在纸片旁边的平板琼脂中刻一裂缝，l在其中加入受试菌液，l如该菌产生ESBLs向四周的琼脂中扩散，l则可观察到变形的抑菌环，l判断为ESBLs阳性。

6.PCR方法11进行扩增ESBLs的特异基因片段(选用TEM、iSHV、iCTX的通用引物)，l可应用多种分子生物学技术进行分型。

(三)AmpC酶检测方法

1.纸片筛选法　Amp1C酶不被CLA和EDTA抑制而被氯唑西林(Cloxacillin)抑制。根据Amp1C酶可以水解头孢西丁，l而ESBL不能水解的特点，l用含头孢西丁(30μg／片)的纸片筛选Amp1C酶菌株，l若抑菌环直径<18mm就用三维方法做确证试验。试验菌株对头孢西丁耐药而对氯唑西林敏感，l判断为可疑产Amp1C酶菌株。

2.三维方法　操作过程与检测ESBLs的三维方法相同。

(1)酶粗提取物的制备：i取可疑产酶细菌加入胰化大豆肉汤中35℃培养4小时，l离心沉淀，l将沉淀物反复冻融5次，l离心取上清即为细菌产生的酶粗提取物，l-20℃保存。

(2)操作方法和结果判断：i按标准纸片扩散法操作，l将ATCC25922大肠埃希菌(标准菌株)的菌悬液均匀涂布于MH平板上，l贴上30μg／片头孢西丁纸片，l在距离纸片边缘5mm处由里向外切开一条直的狭缝，l取25～30μl酶粗提取物加入狭缝内，l35℃培养过夜。如果抑菌环变形并且有细菌扩大生长区，l判断为三维试验结果阳性；反之无细菌生长、i抑菌环呈圆形，l判断为三维试验结果为阴性。

(3)PCR方法　测定Amp1C基因及其调控基因如Amp1D和Amp1C等，l判断有无突变导致持续产酶。

(四)MRSA的测定

MRSA是由于金黄色葡萄球菌获得了macA基因产生PBP2a，l使金黄色葡萄球菌对所有的β内酰胺娄抗生素产生耐药。为了与β内酰胺酶引起的耐药鉴别，l采用耐酶青霉素如甲氧西林、i苯唑西林进行测定。由于甲氧西林在实验过程中容易失活，l而苯唑西林较为稳定，l因此实验测定时均采用苯唑西林。CLSI也推荐使用头孢西丁进行测试。由于MRSA存在异质性表达，l因此需要一些特别的条件。

常用琼脂筛选法，l在MH琼脂中加入4％氯化钠和6μg/ml苯唑西林。将待测菌株悬液涂布或点种在平板上。35℃培养24小时，l观察有无菌落生长。也可以用加入4％氯化钠和不同浓度的苯唑西林进行测定。

采用PCR方法直接测定macA基因是快速和准确的方法。