一、i疾病概述
【病因】
禽流感病毒属正粘病毒科、i正粘病毒属中的病毒。病毒颗粒一般为球形,l直径为80~120nm,l病毒粒子表面有长10~12nm的密集钉状物或纤突覆盖,l病毒囊膜内有螺旋形核衣壳。两种不同形状的表面钉状物是血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。不同的HA和NA之间可能发生不同形式的随机组合,l从而构成许许多多不同亚型。多数亚型属非致病性或低致病性,l高致病性亚型主要是含H5和H7的毒株。
【发病机制】
传染源主要为患禽流感或携带禽流感病毒的鸡、i鸭、i鹅等家禽,l特别是鸡,l不排除其他禽类或猪成为传染源的可能。病毒主要通过呼吸道传播,l通过密切接触感染的禽类及其分泌物、i排泄物.受病毒污染的水等,l以及直接接触病毒毒株被感染。一般认为任何年龄均具易感性,l但12岁以下儿童发病率较高,l病情较重。与不明原因病死家禽或疑似感染禽流感家禽密切接触人员为高危人群。
【临床表现】
发病前1周内曾到过禽流感暴发的疫点,l或与被感染的禽类及其分泌物、i排泄物等有密切接触者,l或从事禽流感病毒实验室工作人员。目前不排除与禽流感患者有密切接触的人有患病的可能。
潜伏期一般为1~3d,l通常在7d以内,l急性起病,l早期表现类似普通型流感,l主要为发热、i体温持续在39℃以上,l热程1~7d,l一般3~4d,l可伴有流涕、i鼻塞、i咳嗽、i咽痛、i头痛和全身不适,l部分患者可有恶心、i腹痛、i腹泻、i稀水样便等消化道症状。重症患者病情发展迅速,l可出现肺炎、i急性呼吸窘迫综合征、i肺出血、i胸腔积液、i全血细胞减少,l肾功能衰竭、i败血症、i休克及Reye综合征等多种并发症。重症患者可有肺部实变体征,l胸部影像学检查重症患者胸部x线可显示单侧或双侧肺炎,l少数可伴有胸腔积液等。
【诊断和鉴别诊断】
根据流行病学史,l临床表现及实验室检查结果,l排除其他疾病后,l可以作出高致病性禽流感的诊断。临床上应注意与流感、i普通感冒、i细菌性肺炎,l传染性非典型肺炎、i传染性单核细胞增多症、i病毒感染、i衣原体肺炎、i支原体肺炎等疾病进行鉴别诊断。
二、i检验诊断
高致病性禽流感的实验室检查主要包括血常规、iH5N1流感病毒培养、iH5N1流感病毒核酸检测及血清学检测H5N1流感病毒抗体等,l实骑室检查对高致病性禽流感的诊断起到关键作用。
【一般检验】
血常规 高致病性禽流感患者白细胞总数一般不高或降低。重症患者多有白细胞总数及淋巴细胞减少,l并有血小板降低。
【特殊检验】
1.病毒分离
(1)检测方法:i采用鸡胚和MDCK细胞分离法。
(2)标本:i疑似禽流感患者的咽、i鼻拭子或含漱液,l死亡病例的尸检肺组织、i气管分泌物等。
(3)标本采集要求:i及时采集咽拭子和血清两类标本。咽拭子的最佳采集时间是患者发病后的3~4d,l血清标本的采集,l需要在患者急性期和恢复期进行,l只有通过对患者急性期和恢复期双份血清检测结果的对比,l才能够准确判定患者是否感染了禽流感。如患者死亡,l只要有可能,l最好采集其肺组织标本。各类样本的采集均应由受过专门培训的人员严格按照样本采集规范进行留取。
(4)临床诊断价值和评价:i病毒分离是人禽流感诊断的金标准。从患者呼吸道标本中分离出特定的H5N1流感病毒,l对诊断高致病禽流感性肺炎有确诊价值。用于病毒分离的标本最好选择急性期的标本,l下呼吸道标本最有利于分离到禽流感病毒。采集患者的标本要采取二级防护措施,l人禽流感标本的处理、i实验室检测要在生物安全二级或三级实验室操作。用于病毒分离和核酸检测的标本应尽快在24h内进行检测,l24h能检测的标本可置于4℃保存,l如不能于24h内接种的标本则应置于-70℃或以下保存。
(5)方法学评价及问题:i禽流感的病毒分离时间需要1周以上,l难以做到早期诊断,l且对实验室的要求高。病毒分离和微量中和试验必须要在生物安全三级实验室内完成,l其他实验也要在二级生物安全实验室进行,l操作人员应采用生物安全三级防护。要确保对可疑病例做出正确的判断,l就必须保证在检测过程中的每一个实验步骤都严格按照操作规范进行。采用的检测试剂必须经国际或国家相关机构认可,l检验人员需接受专门技术培训,l发出报告的流程应严格按照国家或当地权威部门所制定的网络实验室报告流程进行。
2.血清学检查
(1)检测方法:i主要有血凝抑制试验、i微量中和试验、i以及发病初期和恢复期双份血清抗禽流感病毒抗体的ELISA检测。
(2)标本:i血清。
(3)标本要求
1)要确保对可疑病例做出正确的判断,l就必须保证在检测过程中的每一个实验步骤都严格按照操作规范进行。采用的检测试剂、i检验人员、i报告流程等均需严格规范。
2)血清标本应包括急性期和恢复期双份血清。急性期血样应尽早采集,l最迟不超过发病后7d。恢复期血样应在发病后2~4周采集。单份血清一般不能用作诊断。血液标本经21000~21500r/min离心15min后分离血清,l血清可在4℃存放1周,l长期保存置-20℃。标本应在低温下,l24h内送至实验室。
(4)临床诊断价值和评价:i发病初期和恢复期双份血清抗H5N1病毒抗体对高致病性禽流感诊断非常有帮助。急性期血清在发病后7d内采集,l恢复期血清在发病后第2、i3、i4周采集。如未能采集到急性期血清,l仍应尽早采集第一份血清,l并在间隔2~4周后采集第二份血清。同时检测患者急性期(发病数日内)和恢复期(发病2~4周)双份血清,l如恢复期血清抗体效价比急性期升高4倍或以上即可确立诊断。
(5)方法学评价及问题
1)血凝抑制法获得结果快,l只需2天,l但敏感性低,l且易与其他流感病毒呈阳性交叉反应。微量中和试验敏感性高,l确诊意义大,l但需要10d以上时间。
2)微量中和实验技术已被成功应用于检测血清中抗流感病毒甲5型抗体,l并可以推广用于检测血清中其他抗禽流感病毒亚型中和抗体水平,l其敏感性高于血凝抑制实验。由于人群中缺乏抗禽流感病毒特异性抗体,l因此,l检测单份血清即可反映人群的免疫状态。但是当诊断可疑病患时,l则需要同时检测急性期和恢复期双份血清中的中和抗体滴度,l若恢复期血清抗体水平高于急性期(≥4倍)即可确立诊断。
3.病毒抗原检测
(1)检测方法:i免疫荧光法或酶联免疫吸附法(ELISA)检测甲型流感病毒核蛋白(NP)抗原及禽流感病毒H亚型抗原。
(2)标本:i疑似禽流感患者的咽、i鼻拭子或含漱液。
(3)临床诊断价值和评价:i使用H5N1流感病毒特异性抗体检测呼吸道标本中H5N1病毒抗原对诊断高致病性禽流感意义较大,l可做出早期诊断。
4.病毒核酸检测
(1)检测方法:iRT-PCR、i实时荧光定量PCR、iPCR产物测序快速特异地检测禽流感病毒亚型特异性H抗原基因。
(2)检测标本:i疑似禽流感患者的咽、i鼻拭子或含漱液.死亡病例的尸检肺组织、i气管分泌物等。标本要求同病毒分离培养。
(3)临床诊断价值和评价:i采用分子生物学方法,l从患者的临床标本中检测是否有高致病性禽流感病毒的核酸,l是目前对初筛实验室早期筛查推荐的方法。核酸检测是诊断人感染高致病性禽流感病毒的重要手段。
(4)方法学评价及问题:i核酸检测方法比较简便。检测的成功率高低和标本采集的时间和质量有密切关系。普通RT-PCR有较高的特异度但灵敏度较差,l假阴性率高,l且实验过程较长,l约4~5h,l容易发生污染(即出现假阳性和假阴性结果)。实时荧光定量PCR具有灵敏度高,l特异性强的特点,l可以在病毒侵入人体早期进行检测,l以实现对可疑患者和高危人群大量快速筛查,l及评价药物疗效和治愈指标有重要的参考价值。并且由于荧光定量PCR技术能够快速、i精确测定患者体内的病毒拷贝数,l这对于目前的特效药物的筛选和评价工作也有直接的意义。PCR产物测序能准确确定病毒的核酸序列,l及时确定病原体,l但测序仪器价格昂贵,l一般医疗机构难以普及。
【应用建议】
初筛实验室早期筛查可选择分子生物学方法检测H5N1流感病毒核酸,l若需进一步确诊,l需把患者的标本送生物安全三级实验室进行H5N1流感病毒培养。