一、i疾病概述
肺结核(pulmonary1tuberculosis)是结核分枝杆菌引起的慢性肺部感染性疾病，l占各器官结核病总数的80％～90％.是世界上最重要公共健康问题之一。随着AIDS的流行、i人口的流动、i器官移植的出现以及免疫抑制剂的广泛应用，l结核病的疫情呈明显上升，l多重耐药结核菌的感染更为常见。据1990年WHO的调查，l全球现有肺结核患者21000万人.每年新发病例800万～11000万，l结核病的年死亡人数高达300万。我国是世界上结核病疫情负担最重的22个国家之一，l目前我国正积极推行全程督导短程化学治疗(directly1observed1treat-ment1short-course，lDOTS)，l使肺结核患病率明显下降，l治愈率超过94％，l有效地遏止了肺结核的传播。
【病因和发病机制】
1.结核杆菌 结核分枝杆菌是结核病的致病菌，l其包括
人型、i牛型、i非洲型和鼠型，l其中人型结核分枝杆菌是最重要的病原菌。结核分枝杆菌细长可呈多种形态，l无荚膜和鞭毛，l抗酸染色呈红色，l不易被乙醇脱色，l故又称抗酸杆菌。结核杆菌属于兼性需氧菌，l具有较强的耐受性，l在干燥和潮湿的环境中能存活数月甚至数年，l但对高热、i乙醇或紫外线具有较好的敏感性。结核分枝杆菌主要由类脂质、i蛋白质和多糖类组成，l其中类脂质可引起组织坏死、i干酪液化和空洞形成，l蛋白可诱发皮肤变态反应，l多糖类导致免疫应答。
2.发病机制
(1)结核菌阳性，l尤其是痰涂片阳性的肺结核患者是结核病的主要传染源。传染性的大小与痰菌的量呈正相关。飞沫传播是结核病的主要传播途径。所有人群对结核菌均有易感性，l而婴幼儿、i老年人、iHIV患者、i免疫抑制剂使用者、i慢性疾病患者等由于免疫功能不完善或低下，l更易感染结核菌。
(2)人体感染结核分枝杆菌时.大部分病菌可被肺泡内巨噬细胞吞噬杀灭，l部分病菌由于能抵抗溶酶体酶的破坏而存活，l并在肺泡巨噬细胞内外生长形成炎性病变，l同时沿着淋巴管到达肺门淋巴结，l引起淋巴结肿大，l构成原发综合征。
(3)T淋巴细胞介导的细胞免疫是人体对结核分枝杆菌主要免疫保护机制。人体首次感染结核分枝杆菌后，l巨噬细胞分泌多种炎症介质促使淋巴细胞和单核细胞聚集，l形成肉芽肿。当抗原再次进入人体.T淋巴细胞尤其是CD4+细胞可识别特异性抗原，l增加细胞因子或炎症介质的释放，l激活巨噬细胞的吞噬功能，l提高其抗菌活性而达到保护作用。
(4)原发性结核感染后有部分结核分枝杆菌遗留在潜在病灶中，l在某个时期可再次发生结核病或再次感染结核分枝杆菌而出现继发性肺结核。当人体出现免疫功能受损、i营养不良或抵抗力下降，l临床症状表现明显。
【病理】
渗出、i增殖和干酪样坏死是结核病特异性炎症的三种病理改变，l可同时存在，l相互转化。
1.渗出 在结核病初期或病变恶化复发时，l局部血管通透性增加，l组织充血水肿，l中性粒细胞、i淋巴细胞、i单核细胞和巨噬细胞聚集、i吞噬结核菌。当机体T淋巴细胞介导的细
胞免疫功能形成后渗出病变转化为增殖表现，l如果机体超敏反应较强时，l则转向干酪样坏死，l形成空洞。
2.增殖 主要表现为类上皮细胞结节和结核肉芽肿，l其中央可见朗汉斯巨细胞，l外周有淋巴细胞、i浆细胞和巨噬细胞浸润。结核结节可相互融合形成融合性结节。
3.干酪样坏死 机体超敏反应增高或免疫功能低下，l渗出性或增殖性病变呈进展恶化，l干酪样组织液化经气管排出，l形成空洞。部分干酪样组织周围肉芽组织增生，l围以纤维包膜形成结核球或纤维干酪灶。
【临床表现】
肺结核患者常缺乏特征性的临床表现，l20％患者可无症状或仅有轻微症状。全身症状表现为低热、i盗汗、i乏力、i消瘦，l食欲下降、i体重减轻和月经失调。呼吸道表现咳嗽、i咳痰或伴咯血、i胸痛、i呼吸困难等症状。部分患者有结节者性红斑、i关节痛、i泡性结膜炎和结核风湿症(Poncet病)等结核变态反应表现。病变范围较小时一般无明显体征。当病变广泛或继发空洞形成，l叩诊呈浊音，l闻及支气管肺泡呼吸音。胸膜增厚或纤维化明显，l患侧胸廓塌陷，l肋间变窄，l气管向病侧移位，l对侧代偿性肺气肿。
【肺结核分型】
1.原发型肺结核 为原发结核感染所致的临床病症。多见于儿童和青少年。原发病灶、i淋巴管炎和肺门或纵隔淋巴结结核炎症在X线上表现为典型的“哑铃”样病变，l称为原发综合征。
2.血行播散型肺结核 多为原发型肺结核发展而来，l也可继发于肺或其他潜伏病灶中的结核菌进入血液引起。包括急性、i亚急性和慢性血行播散型肺结核，l多见儿童、i青少年和免疫功能低下患者。急性型全身中毒症状明显，l胸片上表现为大小、i密度、i分布一致的“三均匀”粟粒样结节影。亚急性、i慢性者则病变以中上肺野为主，l分布及大小不等。
3.继发型肺结核11是肺结核的主要类型，l包括浸润性、i纤维空洞性和干酪样肺炎等。多见于成年人，l好发于上叶尖后段和下叶背段，l胸部X线可表现为斑片状、i条索状阴影以及空洞、i干酪样肺炎等表现。
4.结核性胸膜炎 包括结核性干性胸膜炎、i结核性渗出性胸膜炎和结核性脓胸。常为胸膜下病灶蔓延所致，l胸片上显示胸腔积液征象。
5.肺外结核 包括中枢神经系统、i消化系统、i泌尿系统、i骨关节等全身的结核病，l多由于原发感染时菌血症所致的病灶。
【肺结核特殊类型】
1.无反应性结核病 又称结核性败血症。多见于严重免疫功能低下患者，l表现为高热、i肝脾和淋巴结肿大，l肺部阴影延迟出现.预后较差。
2.支气管内膜结核 表现为刺激性咳嗽或伴咯血、i呼吸困难，l痰找结核分枝杆菌阳性，l可继发支气管狭窄、i肺不张和阻塞性肺炎等。
3.结核性风湿症 又称Poncet病，l是结核病的变态反应性表现。可见多发性关节痛或炎症样改变，l皮肤上出现结节性或环形红斑。
【并发症】
1.咯血 肺结核咯血多为渗出、i空洞病变或支气管扭曲、i变形或扩张引起，l大咯血可引起窒息、i失血性休克、i肺不张、i结核支气管播散和吸人性肺炎等严重合并症。
2.自发性气胸 胸膜下病灶或空洞破入胸腔，l纤维灶或瘢痕组织导致肺气肿或肺大疱破裂以及肺间质的病变引起间质肺大疱破裂均可出现气胸、i液气胸或脓气胸。
3.肺部继发感染 肺结核空洞、i结核性支气管扩张、i支气管狭窄等是继发细菌、i真菌感染的病理基础。
【诊断和鉴别诊断】
1.诊断 根据患者全身结核中毒症状以及呼吸道的临床表现，l结合典型胸部影像学、i痰找结核杆菌等检查，l诊断较为容易。但肺结核的临床和X线往往不典型，l易与其他疾病混淆。凡遇到下列情况应考虑肺结核可能：i①反复发作或迁延不愈的咳嗽、i咳痰，l或呼吸道感染经抗炎治疗3～4周无好转；②咯血或痰中带血；③长期低热；④体检肩胛间区闻及湿性啰音或于啰音；⑤有糖尿病、i免疫抑制性疾病或接受激素和免疫抑制剂治疗；⑥渗出性胸膜炎或有开放性肺结核密切接触史；⑦关节肿痛和皮肤结节红斑等变态反应性表现。
2.鉴别诊断
(1)原发型肺结核：i支气管淋巴结结核应与结节病、i淋巴瘤、i转移性肿瘤和纵隔恶性肿瘤等相鉴别。
(2)血行播散型肺结核：i应与肺部感染、i细支气管肺泡癌、i癌性淋巴管炎、i肺间质纤维化相鉴别。
(3)继发型肺结核：i应与肺部感染、i肺脓肿、i肺囊肿继发感染、i肺癌等相鉴别。
3.诊断记录程序
(1)按病变范围、i部位、i类型、i痰菌情况和化疗史程序书写。如右上继发型肺结核，l涂(+)，l复治；左侧结核性胸膜炎，l涂(-)，l培养(-)，l初治。
(2)如有必要，l可在类型后加括弧说明。血行播散型肺结核可注明急性或慢性；继发型肺结核可注明空洞或干酪性肺炎等。并发症、i并存病和手术史可在化疗史后按并发症、i并存病、i手术史等顺序书写。
4.相关辅助检查
(1)胸部影像学：i胸部X线检查是诊断肺结核的重要方法，l也是早期发现肺结核的重要体检手段，l可确定病变的部位、i大小、i密度、i形态、i有否伴随空洞以及与周围组织的关系，l判断病灶的变化和疗效。胸部CT易发现微小病变，l更易显示病变的性质和变化，l有利于肺结核的鉴别诊断，l也可以引导穿刺、i引流和介入性治疗。
(2)痰结核分枝杆菌检查：i是确诊肺结核病最特异性方法，l也是确定治疗方案和判断疗效的主要依据。所有肺结核或可疑患者均需查痰(具体方法见检验诊断部分)。
(3)结核菌素试验：i结核菌素主要成分为结核蛋白，l是结核菌的代谢产物。目前主要使用纯蛋白衍生物(purified1pro-tein1derivative，lPPD)。将PPD5IU(0.1m1)注入皮下，l48～72h后观察皮丘硬结直径的变化：i<5mm阴性反应，l5～9mm弱阳性(+)；10～19mm阳性(++)，l≥20mm或<20mm但伴有水泡或坏死为强阳性(+++)。结核菌素试验可受较多因素影响，l包括变态反应尚未建立、i营养不良、i免疫功能低下、i严重的结核菌感染等。
(4)支气管镜检查：i通过支气管镜可获取组织学标本或分泌物、i灌洗液行病原体检查，l提高结核菌检出率。
二、i检验诊断
肺结核的诊断、i治疗离不开实验室的检查.尤其是通过实验室检查检到结核分枝杆菌对肺结核起到明确诊断的作用。
【一般检验】
1.白细胞计数与分类11白细胞检验可作为肺结核不同病程的诊断与治疗的依据。肺结核急性活动期白细胞总数增高明显，l白细胞总数可达(10～20)×109／L，l其中以中性粒细胞增高为主，l甚至出现中性粒细胞核左移和中毒性改变，l淋巴细胞减少，l在严重的浸润型肺结核时，l可致血中单核细胞明显增多，l可达30％以上，l以成熟型为主，l甚至呈单核细胞类白血病反应。肺结核慢性期白细胞总数轻度增高或正常，l其中以淋巴细胞增高为主。随着疾病的好转，l白细胞恢复正常。
2.红细胞沉降率
(1)测定方法：i魏氏法(Westergren法)；自动血沉测定仪测定法。
(2)标本：i抗凝血。一般用109mmol／L枸橼酸钠溶液与血液按1：i4比例使用，l抗凝剂应准确，l抽血要及时，l不能有凝固，l也不能有溶血。
(3)参考范围：i魏氏法 成年男性0～15mm／h，l成年女性0～20mm／h。
(4)临床诊断价值和评价：i血沉测定常作为肺结核是否活动的监测指标，l肺结核于活动期血沉增快明显。病情好转时血沉减慢，l非活动期血沉可正常。但血沉正常亦不能排除活动性肺结核的可能。魏氏法不论男女其血沉值达25mm／h时，l为轻度增快；达50mm／h时为中度增快；大于50mm／h则为重度增快。
(5)方法学评价及问题
1)红细胞沉降率是指红细胞在一定条件下沉降的速度，l简称血沉。且前已知影响血沉的因素很多，l主要包括：i①血浆因素；血浆纤维蛋白原或球蛋白增多可使血沉加快；而清蛋白、i糖蛋白等可使血沉减慢。此外胆固醇可使血沉加快.而卵磷脂可使血沉减慢。②红细胞因素：i严重贫血患者血沉加快，l红细胞增多症时血沉减慢。红细胞直径愈大，l厚度愈薄，l血沉愈快。而球形红细胞血沉缓慢。所以应结合病史，l综合分析结果才能给临床提供有用的信息。
2)魏氏法检测血沉受到抗凝剂、i用血量、i血沉管位置等方面的影响，l如血沉管倾斜、i温度升高致使血沉加快。仪器法已避免了血沉管的影响，l能提供血沉下降过程中3个时期：i①缗钱状红细胞形成期；②快速沉降期；③缓慢沉降期的血沉下降曲线的变化，l对结核病灶活动与否及预后判断有一定价值。
3)其他血沉测定的方法有库氏法、i温氏法、i潘氏法等，l其差别在于抗凝剂、i用血量、i血沉管、i观察时间以及记录结果方面不同。各种方法的参考值有所不同。我国在1983年全国临床检验方法学学术会议上推荐魏氏法作为参考方法。
4)现临床上已较多使用光学毛细管停流动力学法测定血沉，l此法用血液常规分析的EDTA-K2抗凝血直接上机检测，l操作方便，l仪器通过光学原理进行红细胞的分析，l结果自动记录后转换成魏氏法测定值报告。
3.痰液常规检查
(1)测定方法：i外观理学、i显微镜检查及涂片革兰染色。
(2)标本：i痰液，l以晨痰为宜。
(3)临床诊断价值和评价：i肺结核痰液常规检查在临床应用上有一定的参考价值。在疾病的活动期尤其出现咯血，l痰液中可见少量或大量红细胞。肺结核如继发感染时疲液通常变成脓性，l量也增加，l镜下白细胞增多，l以中性粒细胞增高为主，l也可出现少量的红细胞以及来自气管、i支气管脱落的上皮细胞，l痰液涂片革兰染色常显示混合细菌，l需通过痰液细菌培养来鉴定病原菌并进行药敏试验，l为临床提供有效依据。
4.涂片找结核分枝杆菌
(1)测定方法：i有直接涂片法、i集菌检查法，l一般用抗酸染色，l也可用荧光染色检查。
(2)标本：i疲液.以晨痰为宜。
(3)参考范围：i阴性。
(4)临床诊断价值和评价：i痰中找到结核分枝杆菌是确诊肺结核的主要依据，l也是发现传染源、i观察疗效、i决定是否治愈和流行病学调查统计的主要依据和指标。要确定阳性与否至少初诊查痰次数为2次，l最好3次，l必要时应更多。痰涂片镜检抗酸杆菌阳性2次，l结合临床即可明确诊断。痰菌阳性说明病灶是开放性的，l具有传染性。检查阴性并不能排除肺结核，l一般应注意病程、i采样的时机、i方法以及其他原因的影响。治疗中强化期结束与全疗程结束前2个月均应检查痰菌。
(5)方法学评价及问题
1)涂片阳性报告为“查到抗酸杆菌”。
2)为确保痰菌检出率，l可先作即时痰再留夜痰、i晨痰。合格的痰液标本是检验结果的保证。标本收集前，l应清洁口腔，l除去口腔内大量的杂菌，l用力咳出气管深部痰液吐到无菌的容器内，l量不少于1ml。也可收集24h痰液或支气管镜下取支气管肺泡灌洗液，l无痰者可雾化吸人引痰。儿童大多不会咳嗽留痰而常吞咽入胃，l故可抽清晨胃液或呕吐物查菌。标本收集后应及时送检，l如不能及时检查，l可放人冰箱短时间贮存。
3)直接涂片法快速、i简便，l是最常见的检查方法，l但干扰因素多，l检出率不高(抗酸染色镜检阳性率仅30％左右)，l一般需要每毫升痰液含有结核分枝杆菌10万条以上才能检出，l而且不能区分死菌、i活菌，l也不能区分非结核分枝杆菌。对痰结核分枝杆菌量较少，l杂菌和杂质多时，l直接涂片也不易检出，l为了提高痰结核分枝杆菌检出率，l可采取沉淀集菌法、i漂浮集菌法，l每毫升痰液含结核分枝杆菌11000条即能检出，l但需时间较长才能得到结果。也可利用支气管肺泡灌洗液(BALF)检查，l又称为“肺的液体活组织检查”或“肺的液性活检”，l涂片平均阳性事为33.9％。
4)涂片荧光染色法选用金胺O作荧光染色，l可提高涂片效果，l也提高阳性检出率，l适合于大量标本的快速检查，l但荧光物质有时会干扰结果的判断，l导致假阳性。
5.结核分枝杆菌培养
(1)测定方法
1)传统培养法：iL-J培养基法。
2)快速培养法：iBactec1460、iBactec1960等系统，l自动培养、i鉴定，l并进行药敏试验。
(2)标本：i痰液，l以晨痰为好。
(3)参考范围：i阴性。
(4)临床诊断价值和评价：i结核分枝杆菌培养是目前结核菌检查的“金标准”，l痰中培养到结核分枝杆菌是确定诊断与治疗肺结核的主要依据。对于肺结核患者应及早、i多次进行结核分枝杆菌培养，l培养法如得到阳性结果可做菌型鉴定并作药敏试验，l为临床提供可靠的诊断与治疗依据，l使患者能及时接受正确的治疗方案，l及时控制病情，l避免形成耐药结核菌株。
(5)方法学评价及同题
1)标本：i采集应在抗结核治疗之前为好。应做到规范化采集标本，l收集到无菌广口容器内，l及时送检。
2)培养方法：i①传统培养法以每毫升标本含结核分枝杆菌100条以上即为阳性。但此法结核分枝杆菌生长缓慢，l培养周期长，l37℃培养4～6周后才有培养结果，l不利于临床及时诊断和治疗。②Bactec法快速培养，l其原理是细菌利用培养基里含放射性同位素14C棕榈酸脂，l代谢后产生含14C的CO2来检测结核杆菌，l可使报告时间缩短至20d，l也可作药敏试验。但检测条件要求较高，l需配套进口培养基。由于灵敏度高，l一旦出现污染.将产生假阳性结果，l最好能同时作传统培养法验证。
3)菌型鉴定：i分枝杆菌菌型的鉴定常根据培养特征(菌落形态等)和一系列的生化反应(烟酸试验和硝酸盐还原试验等)来确定。由于分枝杆菌的生化反应经常发生变化，l这为其鉴定带来了不确定性。目前可通过分子生物学方法快速、i明确地确定菌型。
4)药物敏感性试验：i每一患者只用一株分离菌株作药敏试验即可。①比例法，l现为国际通用的分枝杆菌药敏试验方法，l采用Loewenstein-Jensen培养基，l检查实验菌株对异烟肼(H)、i利福平(R)、i链霉素(S)和乙胺丁醇(E)等的耐药性。耐药性用在临界药物浓度时的生长菌落的百分数来表示。临界药物浓度：i异烟肼：i0.2μg／ml、i利福平40μg／ml、i链霉素4μg／ml、i乙胺丁醇2μg／ml。结果的判定按常用耐药性标准，l即所有药物均为1％。耐药标准：i含药培养基菌落数／对照管不含药培养基菌落数>1％为耐药。②绝对浓度法，l含药培养基菌落数≥20为耐药。③间接放射性同位素法，l为Bactec1450仪器所用，l快速可靠。
【特殊检验】
1.结核特异性抗体
(1)测定方法：i酶联免疫吸附试验(ELISA法)、i金标法等。
(2)标本：i血清、i痰液。
(3)参考范围：i阴性。
(4)临床诊断价值和评价：i机体感染结核分枝杆菌后能产生特异性免疫应答，l包括细胞免疫(结核菌素测定)和体液免疫(结核抗体)应答。测定体液中结核抗体可间接反映结核感染的存在，l可辅助肺部有结核病变、i但直接痰涂片和(或)结核分枝杆菌培养阴性的肺结核诊断。活动性肺结核多为阳性，l但免疫功能低下者为阴性。随着抗结核治疗时间的延长，l血清抗结核分枝杆菌抗体水平逐渐降低，l也可通过结核抗体水平来评估结核病的转归。
(6)方法学评价及问题
1)ELISA法：i能做到快速、i敏感、i特异、i简便，l但其特异性、i敏感性、i测定方法仍受到许多因素的影响.而且阳性结果不能排除以往感染或非结核分枝杆菌感染、i卡介苗接种等所致。
2)金标法结核抗体试验(TB-DOT)：i该方法是应用现代生物技术提纯结核分枝杆菌特异性外膜抗原，l引进斑点金免疫渗滤试验(DIGFA)原理，l在定性检测的基础上，l引进定量标准色谱卡技术，l用于测定活动性结核患者IgG、iIgA、iIgM抗体的快速血清免疫学诊断，l以及用于化疗后抗体滴度动态跟踪观察，l具有灵敏度高、i特异性强等特点，l能在数分钟内完成检测。具有简便、i快速、i不需特殊仪器等特点，l得到临床广泛应用。
3)由于结核分枝杆菌是胞内苗，l加上结核分枝杆菌的弱抗原性、i属间和种间共同抗原决定簇的存在，l其在机体内的免疫反应是以细胞免疫为主，l感染后的抗结核抗体滴度较低，l而且抗体滴度与病情的相关性未得到充分阐明，l它与细胞免疫镶嵌性、i抗体产生的前缓和后滞作用、i共同抗原决定簇的存在和由于种种原因产生的假阳性和假阴性使结核病血清学诊断一直未取得实质性进展。
2.结核分枝杆菌分子生物学检测
(1)测定方法：iPCR法、i核酸杂交法等。
(2)标本：i痰液。
(3)参考范围：i阴性。
(4)临床诊断价值和评价：i结核分枝杆菌DNA检测具有敏感性高、i特异性强、i快速、i能检出低活力菌等优点，l对早期尤其是痰结核分枝杆菌涂片或培养阴性的肺结核的诊断有一定的价值。由于结核分枝杆菌DNA检测的各种方法存在许多技术上的问题，l还有待进一步的完善与改进，l临床上还未广泛应用。
(5)方法学评价及问题
1)TB-DNA-PCR检查即结核分枝杆菌基因检测，l其基本原理是利用DNA在体外反复“克隆”复制，l在短时间内，lDNA可复制到原来的百万倍。此方法具有快速、i特异、i灵敏度高的特点，l但电泳法定性PCR易出现假阳性(污染及引物的特异性不高等引起)，l限制了其临床应用。
荧光定量PCR技术，l是利用荧光探针的高特异性和PCR扩增的敏感性相结合，l真正实现了结核病的快速诊断。它具有快速(3～4h出结果)、i灵敏(检出率可达到10条菌／毫升标本)、i特异性高的特点.相对常规定性PCR，l减少了许多中间操作环节，l减少了交叉污染机会，l既可定性又可定量检测，l阳性率达60％以上。此方法不受抗结核药物的影响，l这对已开始抗结核治疗，l结核菌生长受到抑制或发生变异而导致培养阴性的结核病有重要的诊断价值，l也可用于评价抗结核用药疗效。
2)核酸杂交法是利用核酸探针，l即能识别特异性核苷酸序列的带标志的一小段DNA分子，l根据DNA双链互补结合原理，l检测标本中结核特异性DNA片段来诊断结核病，l可以
在数小时内完成鉴定。此方法技术复杂，l特异性强、i灵敏度高的理想核酸探针尚缺乏，l如果结合PCR技术，l将标本中的结核菌特异性核酸先进行扩增，l再进行探针检测，l就能更早期、i灵敏、i特异地检测到少量的结核菌的存在，l为临床结核病的诊断与治疗开拓新的领域。
3)除PCR、i核酸杂交对结核分枝杆菌进行分子生物学诊断的方法外，l还有碱基序列测定、i基因芯片检测等分子生物学手段。如16srRNA基因序列测定，l由于分枝杆菌的16srRNA基因序列是高度可变的，l有种的特异性，l即不同种的分枝杆菌其16srRNA基因序列是不同的，l所以可通过测定16srRNA基因序列来鉴定菌种。
基因芯片在基因表达谱分析、i基因诊断、i药物筛选及序列分析等诸多领域呈现出广阔的应用前景，l但要成为临床实验室普遍采用的技术，l仍有许多问题急待解决，l如：i①提高基因芯片的特异性；②简化样品制备和标记操作；③增加信号检测的灵敏度；④高度集成化样品制备、i基因扩增、i核酸标记及检测仪器的研制和开发。
3.L型结核杆菌检查
(1)测定方法：i细胞壁染色法、iL型分枝杆菌培养基培养法、i分子生物学方法。
(2)标本：i痰液。
(3)参考范围：i阴性。
(4)临床诊断价值和评价。
1)凡能破坏肽聚糖结构或抑制肽聚糖合成的因素都可诱导细菌形成L型。结核分枝杆菌在体内外经青霉素、i环丝氨酸或溶菌酶诱导可影响细胞壁中肽聚糖的合成，l异烟肼可影响分枝杆菌的合成，l巨噬细胞吞噬结核分枝杆菌后溶菌酶的作用可破坏肽聚糖，l均可导致其变为L型，l呈颗粒状或丝状。L型结核分枝杆菌是结核分枝杆菌生命周期中的一个重要环节，l是结核分枝杆菌为了适应不良环境的一种保护性反应，l其细胞壁完全或部分缺失，l导致细胞壁中分枝菌酸也全部或部分缺失。
2)L型结核分枝杆菌可在结核患者各种标本中检出。L型结核分枝杆菌的检查对诊断菌阴结核病有极其重要意义。临床上，l细菌L型的主要意义在于细菌仍有致病性，l而且是临床上感染漏诊的主要原因之一。
(5)方法学评价及同题
1)细胞壁染色法有其缺陷，l其只能证明标本内存在L型菌，l但不一定就是L型结核菌，l培养法还须经返祖才可确诊为L型结核菌，l其费时太长。如能在做细胞壁染色及培养的同时，l结合分子生物学方法来确诊是否为L型结核菌，l将大大提高确诊的效率，l而且会使L型结核分枝杆菌检测更加快速，l符合临床需要。
2)细菌L型需在高渗和营养丰富的条件下才能生长，l细菌L型生长缓慢，l无阳性发现可报告无L型细菌生长。
3)细菌L型对抗生素的敏感性往往与原菌有所不同。
4.结核杆菌耐药基因的检测
(1)测定方法：i直接测序法，l单链构象多态性分析(SS-CP)及固相杂交法。
(2)标本：i痰液。
(3)参考范围：i阴性。
(4)临床诊断价值和评价
1)抗结核药物的应用，l使得结核病得到控制和治愈，l然而间断用药、i不合理的用药、i管理不善等致使结核分枝杆菌不能及时被药物杀灭而产生耐药性。耐药结核病导致病程延长，l死亡的危险性增加，l传染性增加，l已成为引起全球结核病急剧上升的原因之一，l特别是耐多药结核病(mdr-th)的发生对结核病控制规划的实施构成严重的威胁。耐多药结核病是指至少对抗结核药物中异烟肼和利福平产生耐药的结核病。耐药性是通过结核分枝杆菌特有细胞壁降低多数药物通透性、i结核分枝杆菌产生诸如β-内酰胺酶的降解酶类和其他药物修饰酶两种途径产生的。通过基因的分析，l染色体突变介导的耐药性是结核分枝杆菌产生耐药的主要形式，l由于靶基因核苷酸的突变，l形成错误的氨基酸顺序，l影响了药物和靶位酶的亲和性，l形成结核分枝杆菌对药物的敏感性下降或耐受。由于基因突变的发生.有2／3以上的结核分枝杆菌菌株对多种抗结核药物产生耐药性。快速鉴定结核分枝杆菌耐药基因类型，l了解结核病患者的耐药状况，l对指导临床的化疗和防止耐药菌株的播散是非常必要的。
2)近年来研究证实：i①耐利福平主要是由于编码RNA聚合酶的rpob基因突变；②耐异烟肼系与katg、iinha／maba、iahpc基因突变有关；③pcna基因突变是耐毗嗪酰胺酶药的主要原因；④编码16srRNA的rrs基因和编码s12蛋白的rps1基因的突变与耐链霉素有关；⑤乙胺丁醇耐药株与embab基因有关。耐多药是由于多种药物靶基因突变所致，l少数耐多药分离株只有一个利福平耐药基因突变.可能只存在一个突变位点，l也可能系检查技术所限，l未能测出所有突变。
(5)方法学评价及问题
1)直接测序法：i是鉴定突变的金标准.利用耐药区域PCR扩增，lPCR扩增产物纯化或克隆化取DNA片段直接测序，l与标准敏感菌株的同一DNA片段比较，l分析碱基突变的位置和分布。目前已应用自动化DNA测序仪分析临床分离的结核杆菌基因突变。
2)聚舍酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)：iPCR-SSCP原理是单链核酸通过自身互补或分子内的相互作用形成折叠构象，l单个核苷酸的突变可造成其构象改变，l从而导致其在非变性凝胶电泳上迁移速度的改变，l是检测单碱基置换和碱基缺失或插入的可靠而简便方法.比直接DNA测序容易进行，l可作为检测的快速筛选方法，l也是一种检测耐药性的有效手段。目前用荧光素标记PCR扩增产物而建立自动化SSCP分析法，l可直接检测痰涂片阳性标本和Bactec阳性培养物中的耐药菌株，l适用于大量标本的快速筛选。
3)固相杂交法：i根据结核分枝杆菌RFP耐药ropb基因突变资料，l设计一组覆盖69bp1ropb高变区的寡核苷酸探针，l包括结核分枝杆菌探针一个，l覆盖69bp1ropb高度区的野生型探针5个，lropb突变特异的撵针4个。依次固定于尼龙膜上，l然后与待测菌株ropb基因扩增片段进行杂交，l根据杂交谱带判断有无突变及突变的类型。因采用多个撩针且固定于尼龙膜上形成多列，l此方法又称为多列探针检测法(line1probe1assay，lLiPA)。该方法可快速鉴定结核杆菌RFP耐药株ropb基因的突变，l适合于临床标本的直接检测。现已有商品化LiPA试剂盒。
5.T淋巴细胞亚群(CD4+细胞／CD8+细胞)目前T淋巴细胞较为明确的两个亚群是辅助性T细胞(Th)和细胞毒性T细胞(Tc)。辅助性T细胞是能够帮助B细胞分化成抗体产生细胞和放大细胞免疫应答的一个细胞群，l表达CD4但不表达CD8。细胞毒性T细胞(Te)是能特异性溶解靶细胞的一个细胞亚群，l表达CD8但不表达CD4。CD4分子可增强对MHCⅡ类抗原的结合，lCD8分子增强对MHCⅠ类抗原的结合。临床检测CD4+细胞／CD8+细胞可作为细胞免疫功能的评价指标之一。
(1)测定方法：i流式细胞仪测定、i荧光免疫组化技术、i酶免疫组化技术等。其原理是利用CD系统的单克隆抗体(MeAb)与外周血单个核细胞反应的百分率，l可确定人T细胞亚群的分布情况。
(2)标本：i肝素抗凝血。
(3)参考范围：iCD4细胞阳性率为(45.7土5.3)％；CD8细胞阳性率为(27.9±5.0)％；CD4+／CD8+细胞比值为1.66±0.33。
(4)临床诊断价值和评价：iT淋巴细胞介导的细胞免疫是人体对结核分枝杆菌主要免疫保护机制。CD4和CD8细胞是结核病产生保护性免疫反应的主要效应细胞。在结核分枝杆菌感染的早期，l活化的CD4和CD8细胞就向感染病灶转移和聚集，l通过递呈抗原、i参与结核结节的形成、i溶解被感染的细胞以及直接杀菌等作用来控制结核分枝杆菌扩散和防止结核病灶的复燃。肺结核尤其是活动性肺结核，l其外周血中的CD4+细胞百分率增加，lCD8+细胞百分率减少，lCD4+／CD8+细胞比值增加明显。
(5)方法学评价及问题
1)流式细胞仪(flow1cytometer，lFCM)是利用流式细胞技术对细胞或颗粒进行快速分析的自动分析仪。近年用流式细胞仪测定T细胞亚群日益广泛，l结果稳定，l重复性好。
2)荧光免疫组化技术、i酶免疫组化技术等主要影响是荧光抗体应有较高纯度，l否则易出现假阳性结果。试验中所用McAb和荧光抗体的最适工作浓度均应通过预试验选择。
3)婴幼儿CD4+细胞数较高而CD8+细胞数较低，l老年人CD8+细胞数下降，l因而其CD4+／CD8+细胞比值较高；男女性T细胞数及其亚群相似.但女性CD4+／CD8+细胞比值高于男性。在分析结果时应对此加以考虑。
【应用建议】
临床上一旦怀疑肺结核就应进行反复多次痰液涂片找结核分枝杆菌，l以及痰液细菌培养和药敏试验，l以检到结核分枝杆菌为诊断依据，l及早确定治疗方案，l控制疾病的传播。如果未检到结核分枝杆菌，l对高度疑似患者应进行结核特异性抗体、iL型结核分枝杆菌检查、i结核分枝杆菌分子生物学等检测，l尽快给临床的诊断提供有效的实验室依据。在肺结核的治疗过程中，l要及时了解机体各系统的状况、i疾病的程度以及药效，l需间断性检测血常规、i血沉、i肝肾功能、i免疫功能等，l对疗效不明显的有必要进行结核分枝杆苗耐药基因的检测，l以有助于肺结核的诊断、i治疗及疗效监测。