(一)疾病概述
莱姆病是由伯氏疏螺旋体(Borrelia1burgdorferi，lBb)引起的一种传染病，l主要通过硬蜱传播。其临床表现除了出现皮肤慢性游走性红斑、i心脏损害、i关节炎症外，l还可表现有复杂的神经系统损害症状。
【病因及发病机制】
蜱叮咬后疏螺旋体侵人皮肤并在局部孵育播散，l形成慢性游走性红斑，l受损皮肤可培养出螺旋体(Ⅰ期)。数日至数周螺旋体经淋巴管进人淋巴结或经血液播散到各器官，l形成循环免疫复合物导致血管损伤，l引起心肌、i视网膜、i肌肉、i骨骼、i滑膜、i脾、i肝、i脑膜和大脑病变，l病理可见脑血管周围淋巴细胞、i浆细胞浸润及内膜增厚。
【临床表现】
根据临床表现，l莱姆病可分三个阶段：i①第一阶段：i开始表现为游走性红斑伴有流行性感冒样或脑膜炎样症状；②第二阶段：i持续数周到数月的神经或心脏异常、i骨骼肌症状和间歇发作性关节炎表现；③第三阶段：i数月到数年后的慢性皮肤、i神经系统和(或)关节损害。神经系统莱姆螺旋体既可影响周围神经系统，l也可损害中枢神经。以下着重分析神经系统表现。
在莱姆病的第一阶段出现慢性游走性红斑后，l患者可以出现脑膜刺激症状，l如头痛发作、i颈痛或颈强直，l可持续数小时，l但脑脊液检查正常。
第二阶段也可以影响脑膜，l持续数周到数月，l约15％的患者出现伴有脑神经或脊神经炎的淋巴细胞性脑膜炎。多数患者的神经系统损害(50％～68％)有脑神经障碍，l常见累及面神经的运动纤维，l有时可以影响双侧，l而无脑脊液细胞数增多。但也有报道淋巴细胞增多而缺乏脑神经或脊神经损害，l因此莱姆病可以误诊为Bell’s麻痹或无菌性脑膜炎。约32％～50％患者可出现用围神经异常，l影响躯干和(或)肢体。周围神经炎常常旱躯干或肢体不对称的运动、i感觉或混合性神经根神经病，l表现为根痛、i感觉异常或感觉迟饨。轻瘫可以影响双侧肢体，l各个肢体损害常常开始于不同时间，l临床损害可以出现在蜱叮咬部的节段范围内，l但通常不符合此规律。少数患者可出现多发性单神经炎或四肢瘫痪，l或格林-巴利综合征表现。神经系统异常可持续数月，l或可以复发或慢性化。
Halpefin等报道莱姆病起病数年后多有间歇性远端感觉异常，l临床检查无客观感觉障碍或仅有轻度感觉异常。根性颈背痛伴发肢体无力和感觉缺失也是慢性神经莱姆病的特点，l电生理研究显示是多发性神经根病，l脑脊液有蛋白增高表现。菜姆病后期能引起多种中枢和周围神经系统综合征。德国学者报道一组患者出现进行性脑脊髓膜炎，l66％患者有痉挛性截瘫或四肢瘫，l有时伴有膀胱功能失调或共济失调；32％有认知功能失调}许多患者伴有脑神经麻痹(第7和8对脑神经)和脑脊液中淋巴细胞增多；其中仅10％过去有过第二阶段的神经功能障碍表现；此组患者神经异常持续7月到12年，l既有进展病程也有缓解复发病程。美国研究者发现莱姆病后期神经功能异常表现为亚急性脑脊髓膜炎，l或出现局灶性脑炎，l如表现为失语及行为异常。
【诊断和鉴别诊断】
莱姆病的诊断主要依据流行病学资料和临床表现。神经莱姆病发生在莱姆病第二阶段，l临床需与慢性或复发性脑膜脑炎相鉴别，l如白塞病、i结节病、i色素层脑膜脑炎、i钩端螺旋体病、i结核性、i真菌性和癌性脑脊膜炎等疾病。而晚期神经莱姆病必须与更多神经系统疾病鉴别，l如进行性脑脊髓膜炎、i多发性硬化和肿瘤鉴别；以局灶性脑炎为表现的莱姆病应与单纯疱疹或其他病毒性感染鉴别；出现行为异常、i记忆衰退或疲劳的莱姆病患者应除外原发性精神疾病或慢性疲劳综合征，l而有较严重认知损害的患者需与早期Alzheimer病鉴别。
(二)检验诊断
莱姆病的病原足疏螺旋体，l只要实验室检到疏螺旋体就可作出诊断。实验还可以通过间接免疫荧光法(IFA)、i酶联免疫吸附试验(ELISA)及免疫印迹法(Westernblot，lWB)检测其抗体进行辅助诊断，l并且还可以借助生物芯片技术检测其基因来明确诊断。
【一般检验项目】
1.血沉莱姆病患者血沉轻度增快，l为非特异指标。
2.脑脊液常规神经莱姆病患者脑脊液细胞数增高，l可达(100～200)×106／L，l以淋巴细胞增多为主，l蛋白轻度增高，l糖含量正常。
【特殊检验项目】
1.伯氏疏螺旋体抗体 伯氏疏螺旋体的外膜、i表面和原生质上有大量具有免疫原性的物质，l比较重要的有表面蛋白OspA、iOspB、iOspC、i41kD鞭毛蛋白、i菌体蛋白39kD蛋白、i83／100kD蛋白和热休克蛋白等。
(1)检测方法：i目前常用的检测方法有间接免疫荧光法(IFA)、i酶联免疫吸附试验(ELISA)及免疫印迹法(west-ernblot，lWB)。
(2)标本：i最好同时采取血清标本和脑脊液标本。
(3)参考范围：i正常人血清和脑脊液中伯氏疏螺旋体抗体阴性。
(4)临床诊断价值和评价；约90％患者有抗体滴度的上升。伯氏疏螺旋体感染后约2周～4周才能出现特异性IgM类抗体，l6周～8周达高峰，l4月～6月内降至正常水平；特异性IgG常在发病后6周～8周内出现，l4月～6月达高峰。一般在病后3周～6周内进行血清检测，l若取早期和恢复期双份血清检测，l恢复期滴度比早期升高4倍以上，l则可诊断。
(5)方法学评价和问题
1)IFA是最早用于血清学诊断的方法，l其操作简便易于掌握，l但结果的判定有主观因素，l且费叫，l不适于大量标本的检测。ELISA的敏感度及重复性优于IFA，l适用于大量标本的检测，l因而更受欢迎。传统的血清学检测多采用伯氏疏螺旋体B31菌株的全菌抗原作为标准抗原，l但因全菌抗原的成分复杂，l特异性不高，l存在交叉反应，l其他种属螺旋体感染、i幽门螺杆菌感染、iEB病毒感染以及非螺旋体的细菌性心内膜炎、i系统性红斑狼疮和结节病等疾病都可能出现假阳性结果，l需要作特异性实验检查以鉴别。改用纯化抗原如41kD鞭毛蛋白或合成抗原如重组外膜蛋白C(rOspC)抗原代替全菌抗原检测，l能提高检测的敏感性和特异性。
2)免疫印迹法(WB)检测的是伯氏疏螺旋体的各种特异性蛋白组分的抗体，l其特异性高于IFA和ELISA，l但操作比较繁琐。为提高检测的特异性，l伯氏疏螺旋体各基因型在世界各国的分布有所不同，l不同的国家应根据自己的情况，l制定相应的WB阳性诊断标准。美国CDC针对基因型Borreliaburgdorferi1sensu1stricto制定的诊断标准是：i在23kD(OspC)、i39kD、i4lkD中有两条蛋白带显色时认为IgM是阳性；18kD、i21kD、i28kD、i30kD、i39kD、i41kD、i45kD、i58kD、i66kD、i93kD中有5条蛋白带显色时认为IgG是阳性。中国CDC传染病预防控制所针对基因型B.garinii制定的标准为：i当OspA、iOspC、i17kD、i30kD、i39kD、i58kD、i66kD、i83／100kD中至少有一条蛋白带显色即可诊断IgG阳性；OspA、iOspC、i17kD、i30kD、i41kD、i58kD、i83／100kD中至少有一条蛋白带显色可诊断IgM阳性。由于Bb的41kD鞭毛蛋白与多种细菌的鞭毛蛋白及热休克蛋白(HSP)具有高度同源的氨基酸序列，l如果只出现针对41kD蛋白的单一条带，l应视为非特异性，l不能单凭这一条带，l作为莱姆病诊断的依据。有研究者提出，l首先用IFA法或ELISA法来初筛，l对阳性者或可疑者再通过WB实验进行确证。WB法在无症状和早期莱姆病中，l对伯氏疏螺旋体与非特异反应的鉴别以及在晚期对该病特异性抗体的识别等均有意义。
2.特异性抗原Bb
(1)检测方法：i用Osp的相应抗体建立ELISA法可检测血清或体液中的Bb抗原，l应用识别BbOsp抗原特定表位的单克隆抗体可捕获标本中的抗原组分。
(2)标本：i血清、i尿液。
(3)参考范围：i正常人特异性抗原检测呈阴性反应。
(4)临床诊断价值和评价：i特异性抗原检测阳性可早期诊断该病。
3.伯氏疏螺旋体基因
(1)检测方法：i目前应用于莱姆病检测的PCR技术主要箱标准PCR和套式PCR，l用于试验的引物主要有两种：i一种是根据伯氏疏螺旋体OspA基因、i编码41鞭毛蛋白基因和来源于B31的重组DNA基因设计的SNl和SN2、iOspA1和OspA2、iOspA-N1和Osp-C1、iOspA-N2和OspA-C2、iOspA2和OspA4数对引物和SN3、iOspA3两个探针。上述引物和探针对属内外其他细菌无扩增反应，l但对部分伯氏疏螺旋体也无反应；另一种根据鞭毛蛋白的基因设计了WK1和WK2、iF1和F3两对引物及WK3、iF2两个探针，l这些引物和探针不仅对伯氏疏螺旋体有反应，l对属内其他螺旋体如回归热螺旋体也可反应。由于上述两类引物的特异性均不够理想，lFikrig等根据来源于B31的重组没计了a和a’、ib和b’、ic和c’、id和d’、if和f’5对引物，la／a’扩增所有北美菌株和部分欧洲菌株，lb／b’和f／f’扩增其他欧洲菌株和l株日本株，lc／c’扩增所有伯氏疏螺旋体。
(2)标本：i脑脊液、i血液。
(3)参考范围：i正常人PCR检测脑脊液和血液伯氏疏螺旋体呈阴性。
(4)临床诊断价值和评价：i现在已经有越来越多的研究者采用PCR对患者皮肤、i血液、i脑脊液、i尿、i关节液、i组织、i宿主动物脏器及蜱中伯氏疏螺旋体的核酸序列进行检测。PCR法检测快速方便、i灵敏、i特异、i所需样本量少，l并可在疾病早期抗体还未出现时检测出病原体的存在，l弥补了血清学方法在早期诊断上的不足，l同时利用PCR法还可对菌株进行基因型的鉴定，l这对于莱姆病的流行病学调查、i诊断、i治疗和疫苗研制都具有十分重要的意义。
(5)方法学评价和问题
1)标准PCR是常规的单轮扩增，l灵敏度不及套式PCR。套式PCR是对标本进行两轮PCR扩增，l使灵敏度得到提高，l同时两对特异性引物的应用，l也使特异度得到提高，l但套式PCR法在第一轮扩增后需要打开反应管，l故容易被污染。1996年，lPicken等首次采用了单管套式PCR检测伯氏疏螺旋体DNA，l因其无需存反应过程中打开反应管，l从而降低了污染的可能性。
2)PCR法的缺点是：i对实验条件设备和操作过程有较高的要求；PCR试验的影响因素较多，l标本中的抑制物如尿液中的尿素、i组织中的宿主DNA、i血液中的血红蛋白等可导致假阴性结果;由于其高度敏感性，l即使标本中有微量的交叉污染亦可导致实验出现假阳性结果，l并且阳性结果亦不能区分被检标本中螺旋体的死活，l故在一定程度上不能作为指导临床治疗的依据。
4.病原直接检查
(1)检测方法：i病原直接检查用暗视野光学显微镜直接检查，l采取的标本用可疑患者的组织及体液等标本的切(涂)片，l可见到以滚动、i翻转等形式活泼运动的疏螺旋体。另外标本也可经组织学染色或特异的直接荧光抗体染色后镜检。
(2)标本：i感染早期的皮肤组织、i淋巴液和血液。
(3)参考范围：i正常人未检出伯氏疏螺旋体。
(4)临床诊断价值和评价：i病原直接检查法检出伯氏疏螺旋体可确诊该病。病原直接检查方法直观快速，l但无法保留病原体，l并且由于患者标本中含菌量很低，l检出率较低，l不作为常规检测方法，l主要用于莱姆病的宿主动物、i传播媒介的带菌调查及临床患者的早期、i快速诊断。
5.病原体分离培养
(1)检测方法；病原分离培养用于分离培养的标本主要有宿主动物脏器、i蜱中肠及莱姆病患者的游走性红斑的皮损组织、i皮下组织、i淋巴结、i血液、i脑脊液、i关节滑液等。将标本用Barbour-stonner-Kelly培养基在5％～10％CO2和30℃～37℃条件下培养，l每周取样用暗视野显微镜观察，l若有螺旋体生长，l应立即传代，l以便进一步鉴定证实。如1个月后仍未见螺旋体生长则盲传一代，l2个月后仍未见螺旋体生长才可判为阴性。检出和分离出的螺旋体可用相应的单克隆抗体或分子生物学方法进一步确定。
(2)标本：i脑脊液、i脾、i破损的皮肤等。
(3)参考范围：i正常人伯氏疏螺旋体培养阴性。
(4)临床诊断价值和评价：i病原分离培养结果客观，l可保存病原体，l临床标本中分离培养出伯氏疏螺旋体仍是目前菜姆病诊断的“金标准”，l标本中一旦检出伯氏疏螺旋体便可确诊，l其在莱姆病诎J查及确定疫源地中有不可替代的作用，l但患者体内的伯氏疏螺旋体在整个病程中数量不多，l分离检出率较低，l以及伯氏疏螺旋体培养时间长、i培养基较昂贵等因素使其难以作为常规的临床检测项目。一期游走性红斑(EM)皮损Bb培养阳性率为50％，l二期EM患者阳性率接近90％，l由于二期EM临床症状往往较为典型，l通过观察临床表现，l询问蜱叮咬史或血清免疫学检测大都可以确定诊断，l一般无需进行培养。因此，l皮肤Bb培养目前主要用于一期EM，l尤其是非典型目未经治疗的EM的诊断和鉴别诊断。
(5)方法学评价和问题：i目前国内分离培养伯氏疏螺旋体广泛采用的是王昭孝等发明的改良法，l与常规法相比，l不仅伯氏疏螺旋体生长迅速，l杂菌生长相对缓慢，l标本分离阳性率更高，l检出时间也较常规法提前5天～8天，l而且培养基用量大大减少。
6.免疫反应细胞
(1)检测方法：i淋巴细胞增殖试验。用密度梯度离心分离患者血液中的淋巴细胞。取淋巴细胞于平底微量滴定板孔中，l加入经超声波处理的已知伯氏疏螺旋体抗原。37℃、i5％CO2中孵育5天。在孵育终止前18h加入3H-TdR，l然后用液体闪烁计数仪检测放射性强度。
(2)标本：i肝素抗凝血。
(3)临床诊断价值和评价：i机体受Bb感染后发生针对Bb的特异性免疫应答。T淋巴细胞致敏后可发生增生反应，l因此可根据T淋巴细胞对特定抗原的增生反应来判断感染情况。对早期莱姆病患者的特异性细胞免疫和体液免疫检测结果表明，l培养阳性的ECM患者在急性期和恢复期具有对OspA、iOspC和重组鞭毛蛋白FIaB抗原的特异性细胞免疫应答，l并出现抗OspC和FIaB的抗体，l但只有少数人出现抗OspA的抗体。有少数病例既无可检出的抗原，l也无可检出的抗体，l可用本法来证实诊断。本法的敏感性为45％，l特异性为95％。由于Bb与其他种属的微生物蛋白组分存在交叉反应，l细胞免疫检查的结果也有假阳性的可能。免疫细胞学检查操作较复杂，l一般不作为常规检测项目。
7.脑脊液寡克隆带
(1)检测方法：i琼脂糖电泳、iSDS-PAGE、i免疫印迹法等。
(2)标本：i脑脊液。
(3)参考范围：i正常人无脑脊液寡克隆带。
(4)临床诊断价值和砰价：i病后4周～5周可出现脑脊液寡克隆带，l提示鞘内免疫球蛋白合成。脑脊液寡克隆带检测是神经莱姆病非特异指标。寡克隆带可出现在多发性硬化症患者、i感染性神经系统疾病(阳性率28％～72％)以及一些神经系统非感染性疾病(阳性率2％～28％)中。
8.生物芯片技术
(1)检测方法：icDNA表达谱芯片法。
(2)标本：i脑脊液、i血清。
(3)临床诊断价值和评价：i有研究者用cDNA表达谱芯片对三种不同生长条件下伯氏疏螺旋体B31株11754个基因的开放阅读框(ORFs)进行了检测，l发现其中的150个基因呈差异性表达，l认为该差异性可作为莱姆病诊断的依据。有研究者还利用2×96孔(孔径1.5mm)Teflon膜覆盖的金箔玻璃(25mm×75mm)制备蛋白质生物芯片对莱姆病EM和神经性莱姆病(Neuroborreliosis，lNB)进行研究，l以Strep-Tavidin修饰芯片作为载体包被生物素化的鞭毛素抗原以及外膜蛋白C的C端保守区8个氨基酸多肽片段，l检测这些患者血清中相应IgM和IgG抗体的表达状况。结果发现，l鞭毛素抗原IgM抗体阳性率为73.9％，lIgG抗体为48.9％；抗OspC8多肽IgM抗体为37.5％，lIgG抗体为1.1％，l这一现象的产生可能与OspC8多肽免疫原性较低有关。
(4)方法学评价和问题：i蛋白质芯片检测的优势在于一次实验可以完成大量样本的分析，l仅需微量稀释血清(每孔1μ1)，l具有良好的重复性(CV11.5％～4.5％)和较长的保质期(4℃储存>6个月)，l同时检测信噪比优于传统微滴定板。
【应用建议】
1.神经莱姆病实验室的确诊试验有：i患者血液、i脑脊液和皮肤伯氏疏螺旋体分离培养+直接检查伯氏疏螺旋体。但病原体分离培养或直接检查伯氏疏螺旋体十分困难，l临床上不常用。
2.辅助诊断组合：i脑脊液常规+伯氏疏螺旋体抗体检测+脑脊液寡克隆带+特异性抗原Bb。
3.分子生物学检验选取项目：i伯氏疏螺旋体基因+生物芯片技术。该项目多用于科研。