(一)疾病概述
弓形虫病(toxoplasmosis)是由刚地弓形虫(toxophasma1gondii)所引起的人畜共患的传染病。在人体多为隐性感染，l临床表现复杂，l其症状和体征又缺乏特异性，l易造成误诊，l主要侵犯眼、i脑、i心、i肝、i淋巴结等。人感染率为0.1％～30％，l是人类先天性感染中最严重的疾病之一。
【病因及发病机制】
弓形虫不同于其他大多数细胞内寄生病原体，l几乎可以感染所有类型的有核细胞。弓形虫从入侵部位进人血液后散布全身并迅速进人荦核巨噬细胞，l在宿主的各脏器或组织细胞内繁殖，l直至细胞胀破，l逸出的原虫(速殖子)又可侵入邻近的细胞，l如此反复，l造成局部组织的灶性坏死和周围组织的炎性反应，l此为急性期的基本病变。如患者免疫功能正常，l可迅速产生特异性免疫而清除弓形虫形成隐性感染；原虫亦可在体内形成包囊长期潜伏，l一旦机体免疫功能降低，l包囊内缓殖子即破囊逸出，l引起复发。如患者免疫功能缺损，l则虫体大量繁殖，l引起全身播散性损害。弓形虫并可作为抗原，l引起过敏反应、i形成肉芽肿样炎症。此外，l弓形虫所致的局灶性损害，l尚可引起严重继发性病变，l如小血栓形成、i局部组织梗死，l周围有出血和炎症细胞包绕，l久而形成空腔或发生钙化。弓形虫可侵袭各种脏器或组织，l病变的好发部位为中枢神经系统、i眼、i淋巴结、i心、i肺、i肝和肌肉等。
【临床表现】
弓形虫病有先天性感染和后天获得性感染两种类型，l先天性弓形虫病是经生殖道通过胎盘感染胎儿，l病变多在脑部，l特别是脑室周围。后天获得性感染是由于食人含有包囊的未煮熟的肉类和饮用被囊合子污染的水等，l弓形虫从入侵部位进入血液后散布全身，l也可侵人脑部，l引起脑部炎性改变。
1.先天性弓形虫病11弓形虫经胎疵感染胎儿引起，l临床表现不一。受感染的婴儿出生时可无症状，l其中部分于出生后数月或数年发生视网膜脉络膜炎、i斜视、i失明、i癫痫、i精神运动或智力迟钝等。出生时即有症状者可柏下列不同组合的临床表现：i视网膜脉络膜炎；脑积水或无脑儿、i颅内钙化，l伴脊柱裂、i脑脊膜膨出、i兔唇腭裂；肾上腺缺如、i多囊肾；联体畸胎等；抽搐、i精神运动障碍；淋巴结肿大、i肝脾肿大、i发热、i黄疸、i皮疹等。
2.后天获得性弓形虫病病情轻重不一，l从亚临床性至暴发性感染不等。可为局限性或全身性：i①局限性感染以淋巴结炎最为多见，l约占90％。常波及颈或腋窝部，l质韧，l大小不一、i无压痛、i不化脓，l可伴低热、i头痛、i咽痛、i肌痛、i乏力等，l累及腹膜后或肠系膜淋巴结时，l可有腹痛。临床表现可类似传染性单核细胞增多症或巨细胞病毒感染，l但弓形虫病引起单核细胞增多综合征者很可能不足1％。较少见者尚有心肌炎、i心包炎、i肝炎、i肌炎、i多发性肌炎、i胸膜炎、i腹膜炎等。视网膜脉络膜炎极少见；②全身性感染多见于免疫缺损者(如艾滋病、i器官移植、i恶性肿瘤等)以及实验室工作人员等，l常有显著全身症状，l如高热、i斑丘疹、i肌痛、i关节痛、i头痛、i呕吐、i谵妄，l并发生脑炎、i心肌炎、i肺炎、i肝炎、i胃肠炎等。
【诊断和鉴别诊断】
1.流行病学家中养猫或与猫有密切接触史，l曾食未煮熟的动物肉及饮用不洁生水史，l妊娠期感染弓形虫的母亲所生的婴儿易患此病。
2.典型临床表现如视网膜脉络膜炎、i脑积水、i头小畸形、i眼球过小及脑钙化等。
3.实验室检查方可确诊。如病原体检查、i血清学反应、i皮内试验等。
鉴别诊断：i先天性弓形虫病应与Torch综合征(风疹、i巨细胞病毒感染、i单纯疱疹和弓形虫病)中的疾病相鉴别。此外，l尚需与梅毒、i李斯特氏菌或其他细菌性和感染性脑病、i败血症、i传染性单核细胞增多症、i淋巴结结核等多种发热性全身性疾病相鉴别，l鉴别主要依靠病原学和免疫学检查。
(二)检验诊断
凡有与猫等动物密切接触史并出现头痛、i偏瘫、i癫痫等脑弓形虫的临床表现的免疫缺陷人群应考虑本病，l检测血清弓形虫IgG、iIgM抗体对诊断有一定帮助，l在中枢神经系统组织中检出弓形虫即可确诊。
【一般检验项目】
1.血常规脑弓形虫病患者嗜酸性粒细胞百分比增多，l比例多超过10％或更多。
2.脑脊液常规脑弓形虫病患者，l脑脊液细胞数增加，l以嗜酸性粒细胞增多为主，l蛋白含量增高，l糖和氯化物多正常，l有部分患者脑脊液中可找到幼虫。
【特殊检验项目】
1.病理组织切片分析可在立体CT引导下针吸行脑组织活检，l常规组织染色很难看到滋养体，l对怀疑本病的组织切片应用间接荧光、i过氧化物酶一抗过氧化物酶技术或电镜检测。组织切片或脑脊液涂片经瑞氏染色找到速殖子可以确诊急性感染；银染色检查包囊壁、iPAS(peroidic1acid1schiff)染色缓殖子可以检查慢性感染。免疫过氧化物酶法染色、i免疫组织化学染色、i荧光或标记抗血清有助于虫体鉴定。
2.免疫学分析
(1)IgG抗体
1)检测方法；Sabin-Feldman染色实验(DT)、i酶联免疫吸附试验(ELISA)、i间接免疫荧光试验(IFA)、i改良直接凝集试验、i鉴别凝集试验(AC／HS试验)、i免疫印迹试验。
2)标本：i血清或脑脊液。
3)临床诊断价值和评价：iIgG抗体通常在感染后1周～2周出现，l1个～2个月达到高峰，l然后以不同的速率下降，l通常持续终生.因此血清或脑脊液中弓形虫抗体阳性，l可提示曾经感染，l但不能确诊。Sabin-Feldman染色活的虫体实验阳性，l可以诊断弓形虫感染。
4)方法学评价和问题：iSabin-Feldman染色实验(DT)操作费时，l且需要活的虫体，l常规实验室应用受到限制，l但此方法可以作为弓形虫检测的金标准。鉴别凝集试验(AC／HS试验)有助于判断急性或慢性感染，l但最好与其他试验同时使用。免疫印迹试验可以区分来自母体或胎儿新生儿自身合成的抗体，l所以可以用来检测出生10天之内的婴儿。弓形虫IgG抗体亲和力高可以排除发生在3个～5个月内的感染，l低亲合力提示近期感染。IgG亲和力分析是判断急性或慢性感染很有效的检测指标，l可以作为一种确证试验，l也是血清学检测
的补充，l但有作者认为IgG亲和力分析不适用于检测免疫受损患者。
(2)IgM抗体：iIgM抗体比IgG抗体出现早、i下降快。常用于测定IgM抗体的试验有免疫捕获法、iIFA、i免疫吸附凝集试验(IgM-ISAGA)及免疫印迹试验。有些患者的IgM抗体在慢性感染中仍然存在，l有报道IgM抗体在急性感染后12年仍然存在，l这样的结果没有任何临床意义，l应该被定为慢性感染。由于类风湿因子及抗核抗体等因素的干扰，lIgM检测常出现假阳性结果，l所以阳性标本应该做确证试验。
(3)IgA抗体：iIgA抗体能够持续数月或1年以上，l可以通过ELISA法或ISAGA法检测。在一些先天性弓形虫病的新生儿中IgM抗体阴性，l而通过IgA及IgG可以辅助诊断。
(4)IgE抗体：iIgE抗体血清学阳性叫间短，l它与IgG抗体同时出现，l峰值出现在感染后2个～3个月，l随后迅速下降，l因此它的出现有助于确定近期感染。Foudrini等用特异性IgE-ELISA检测先天性弓形虫病敏感度与IgM、iIgA相比为59.5％，l64.3％，l76.2％，l特异度91.9％，l同时测定IgE、iIgM、iIgA等3种抗体可以提高诊断效率，l敏感度达到81％。Wong等认为IgE抗体检测适用于孕期感染、i弓形虫淋巴结炎及先天性弓形虫检测，l而不适用于弓形虫脉络膜视网膜炎及AIDS弓形虫脑炎的检测。
3.弓形虫核酸探针分析
(1)DNA探针：iAubert等用非同位素标记探针的酶联免疫渗滤试验检测转移到硝酸纤维素膜上的弓形虫DNA。Angel等用ABGTg7标记的探针点杂交检测急性弓形虫脑炎患者的DNA，l敏感度为66.7％。Blanco等用限制性内切酶Hpa1Ⅱ切割弓形虫DNA得到一些重复的DNA片段，l通过点杂交pTg4可以检测80pg的弓形虫DNA。
(2)核糖体RNA(rRNA)探针：iMacPherson等以5种针对小亚单位核糖体RNA(SSU1rRNA)的寡核苷酸探针检测弓形虫rRNA，l可以检出1ng～10ng的RNA含量，l与其他球虫属无交叉反应。Gajadhar等用32P标记的20个碱基的寡核苷酸探针检测SSU1rRNA，l也达到1ng的检测水平。
4.弓形虫基因多聚酶连反应(PCR)分析
(1)引物
1)基因引物：i35倍莺复的多拷贝基因，l序列高度保守，l是目前最为理想的引物之一。
2)P30(SAG1)基因引物：iP30是一种主要表膜抗原，l在大多数虫株非常保守，l是常用的引物之一。对P30的反应可见于急性期，l慢性期和先天性感染。
3)核糖体DNA引物(rDNA):具有种特异性和种内群体特异性，l因此可作为PCR的靶基因。Jones等用B1、iP30和rDNA3种引物设计的套式PCR检测房水弓形虫DNA，l比较三者的敏感性，l以B1基因为引物能检出相当于一个速殖子的DNA，l而P30和rDNA引物的敏感性略低于B1基因。
4)TGR核酸序列：i一组酶切重组克隆，l其中TGRIE是重复数最高且最为保守的片段。
5)529bp片段Homan发现529bp片段在弓形虫基因组中重复200倍～300倍，l以它为引物的PCR反应比B1基因更敏感，l以它为引物的定量竞争PCR可以计数慢性感染小鼠脑中包囊的数目，l还可以通过确定速殖子中529bp的含量来估计每个包囊中缓殖子的数目。
(2)PCR类型
1)套式PCR(nested1PCR)：i设计两对引物，l外引物含有内引物的部分序列，l经两次扩增，l大大提高了PCR的敏感性和特异性。糜祖煌以两对B1基引物建立了套式PCR扩增弓形虫基因，l发现套式PCR比普通PCR敏感两个数量级。Martinez等用套式PCR-ELISA检测弓形虫DNA，l确定检测闽值并与Southern印迹相对比，l将杂交时间及探针浓度标准化，l认为PCR-ELISA可以作为弓形虫常规检测试验。
2)定量竞争PCR：i设立与目的基因有相同引物结合部位(同源性竞争模板)或有不同引物结合部位(异源性竞争模板)的内参照。通过扩增后内参照的DNA产物含量来推算标本中目的DNA或mRNA的含量。Lee设计了含4个引物结合位点的人工竞争物的定量竞争套式PCR检测方法，l竞争物可作为定量的参照，l又可以检测假阴性结果。
3)多熏PCR：i为了同时检测几种病原体而在一个反应体系中加人多对引物以扩增不同的DNA片段，l操作快速简便。Roberte用多重PCR同时检测AIDS患者脑脊液中弓形虫及EB病毒，l达到鉴别诊断的目的。
4)原位PCR：i在组织切片或细胞涂片的原位对DNA或RNA进行扩增，l将原位杂交的定位性与PCR的高敏感性结合起来，l省却了提取DNA的繁琐步骤，l可以同时观察组织病变、i进行虫体定位、i动态观察虫体的感染情况。
5)逆转录PCR(RT-PCR)：i以RNA为模板.在逆转录酶的作用下，l由人工合成的引物介导生成eDNA模板，l在TaqDNA聚合酶作用下，l扩增产生大量的特异性DNA片段。Cultrera等用RT-PCR检测人标本中缓殖子的表达，l从而区分急性感染或者慢性感染，l扩增MAG1、iSAG4、iSAG1基因以达到区分不同感染阶段的目的。
6)荧光定量PCR(FQ-PCR)：i可采用与DNA双链特异性结合的荧光染料(SYBR1Green1I)、i荧光共振能量转移(FRET)的杂交探针技术及水解探针模式(即1Taqman技术)。探针荧光信号的强度随基因量的增加而增加，l从而达到定量的目的。试验采用闭管操作，l避免了后处理时易出现的污染，l实时定量检测克服了传统PCR方法的平台效应。Lin等以寡核苷酸为引物，l建立了以荧光标记的Taqman探针扩增弓形虫B1基因的实时PCR方法，l可以检测出含0.05个速殖子的标本。
【应用建议】
1.弓形虫检测的确诊建议组合实验 脑脊液常规+病理组织切片分析+弓形虫核酸探针分析+弓形虫基因多聚酶连反应(PCR)分析。
2.过筛确立检验项日11血常规+脑脊液常规+弓形虫IgG、iIgM、iIgA抗体。