一、i疾病概述
肝豆状核变性(hepatolenticulal1degeneration，lHLD)亦称Wilson病(WD)，l是一个常染色体隐性遗传的铜代谢障碍的疾病。铜在人体内对于各种不同的氧化酶的功能是一种必不可少的微量元素，l当过多的铜溢入及沉积在各器官内则会发病。本病的临床表现呈多样化，l起病的过程及病情进展在患者间也差异很大。但其主要特征是进行性肝硬化、i以基底节损害为主的神经系统症状及角膜Kayser-Fleischer环(K-F环)。
【病因殛流行病学】
肝豆状核变性的基本病因是过多的铜溢人及沉积在各器官内。本病可发生于任何人种与地区。全球患病率在1／3万以下，l杂合子基因携带者的频率在1／90以下。患病率及发病率各国的报道不一，l本病在我国尚无大宗资料的流行病学报告，l根据中山大学第一附属医院神经科11981年～1991年神经遗传专科门诊957例初诊病例分析，l肝豆状核变性共97例，l占10.14％，l居全国单基因遗传病的第2位，l可见本病在我国并不少见。
【发病机制和病理】
1.发病机制
(1)摄人的铜在血中与清蛋白疏松的结合而形成游离铜，l在正常人，l此游离铜至多仅占血中总铜量的2％～5％，l进人肝内的大部分(95％～98％)的钢则由清蛋白转入α2球蛋白牢固地结合形成铜蓝蛋白(ceruloplasmin，lCP)。本病患者血清游离铜增多，l铜蓝蛋白减少。游离铜易与清蛋白分解，l沉积于组织内或经尿排出，l组织中过量的铜可影响各种酶的活性，l引起染色质分解和细胞坏死，l大量铜也可直接损害组织器官，l导致功能异常。
(2)铜代谢异常的原发性缺陷至今未完全阐明，l曾先后提出以下7种假说：i
1)胃肠对铜的吸收过多：i有人认为肝豆状核变性患者粪便铜减少，l是由于胃肠道吸收铜增加的缘故。目前此种假说已被否定。
2)铜蓝蛋白的异常：i由于肝豆状核变性患者的血清铜蓝蛋白明显减少，l因而有学者认为铜蓝蛋白合成障碍是本病最基本的遗传缺陷。也有人认为本病铜蓝蛋白基因缺陷，l使其结构发生改变，l随之结合铜的能力也发生改变，l导致铜沉积于组织和器官。可是近来发现无铜蓝蛋白血症(acerulopiasmin)孙为常染色体隐性遗传病，l其特点为无血清铜蓝蛋白，l而有中枢神经系统的铁代谢障碍，l引起视网膜和基底节进行性变性，l井无铜代谢障碍，l也无肝豆状核变性的症状，l故该假说也不能成立。
3)调控基因异常：i有人提出结构基因或调控基因异常，l使胎儿的正铜平衡状态不能转变为正常儿童或成人的负铜平衡状态。
4)异常蛋白的存在：i此说是指肝豆状核变性患者细胞内存在一种与锏离子有极高亲和力的异常蛋白质，l此种蛋白质与铜离子牢固结合后，l阻碍了铜蓝蛋白的合成，l也使胆道排铜减少，l加剧铜离子在体内沉积。已有许多人从肝、i肾、i脑组织中分离出金属硫蛋白(metallothionein，lMT)，l其含铜量显著高于对照组。现已发现正常人肝组织内MT既能将铜传递给肝内新合成的原铜蛋白(ApoCP)，l又能使铜通过溶酶体排出肝细胞进入胆道，l因此MT异常可以解释肝豆状核变性患者的溶酶体缺陷与其血清铜蓝蛋白降低。
5)溶酶体缺陷：i本病早期，l铜弥散分布于细胞质内，l晚期集中在溶酶体内。有人认为肝豆状核变性患者胆汁排铜障碍与溶酶体功能缺陷有关。其溶酶体内铜量高而胆汁铜却低于正常人，l说明本病患者可能存在溶酶体缺陷，l使铜不能释放入胆汁而沉积于体内。
6)胆道排铜障碍：i胆道是人体排铜的主要途径，l有人证实肝豆状核变性患者胆汁中铜含量及每日排铜量均显著低于正常人，l而导致体内铜沉积。
7)分子水平发病机制：iATP酶参与跨膜转运铜的代谢过程，l它利用天冬氨酸残基磷酸化的同时实现离子的转运，l故又称为P型ATP酶(p-type1ATPase)。已证实肝豆状核变性患者基因的cDNA与Menke病基因相类似，l其产物可结合铜离子。有多个主要功能区，l其中P型ATP酶功能区，l是肝豆状核变性基因突变常涉及的位点。肝豆状核变性基因可使神经细胞及肝细胞膜对铜离子代谢功能发生障碍，l使过量的铜沉积于脑、i肝细胞内产生细胞毒性作用，l破坏神经细胞核及细胞器，l使其丧失正常的形态和功能，l同时铜跨膜转运功能及P型ATP酶蛋白合成功能亦发生障碍，l因而引起体内铜代谢异常。
2.病理
(1)脑的病理改变：i脑部的病理改变以壳核最明显，l其次为苍白球及尾状核，l大脑皮质亦可严重受侵，l在个别病例丘脑底核、i红核、i黑质、i丘脑及齿状核亦可以受累。壳核最早发生变性，l然后病变范围逐渐扩大到上述诸结构。在具有脑部症状的患者，l脑的表面正常，l而切面则见壳核萎缩，l岛叶皮质内陷，l壳核及尾状核色素沉着加深，l严重者基底节可以形成奎洞。镜检可见壳核内大小细胞体和髓鞘纤维显著减少或完全消失，l变性区内胶质细胞显著增生，l整个基底节、i大脑皮质、i邻近的白质、i中脑核及齿状核等处均有同样的变化。
(2)肝脏的病理变化：i肝脏一般均呈小叶性肝硬化，l体积缩小，l表面呈结节状，l结节大小不一，l其直径可自1mm～30mm，l结节之间由坚固的纤维带形成中隔。肝小叶因含铜量不等及胆汁染色与脂肪变性的程度不等而呈红棕色至黄色。电子显微镜下观察，l肝细胞内含有巨大的线粒体，l并伴有不全晶体的包涵体。在肝细胞中多囊泡状的圆形的颗粒被认为是肝豆状核变性的特征性的改变，l通过x线吸收分析，l显示铜含量的增加。从实用的目的出发，l对于未经过治疗的患者的肝脏活检标本，l用分光光度计测定其吸收值，l可以得出可信结果。
(3)角膜的病理：i铜离子在眼角膜后缘弹力层(角膜的Descemet膜)内的沉积则形成角膜色素环，l称Kayser-Fleis-cher环(K-F环)。
【临床表现】
1.一般症状与体征本病发病年龄在4岁～50岁之间，l但60％～70％的病例发生在20岁以前，l国人也有60岁以后的晚发病例。男性患者多于女性。约30％的患者有阳性家族史。以神经症状为首发症状者占50％，l精神症状首发者占20％，l肝病首发者占20％；大约1／4的患者锥体外系症状与精神症状并存，l另外1／4患者锥体外系症状和肝脏症状并存，l锥体外系、i肝脏及精神症状并存的病例占1／3。少数病例表现为骨肌型。肝豆状核变性呈多器官损害。
2.肝脏损害的症状 本病的肝脏症状可表现为急性肝炎、i慢性肝炎、i肝硬化，l亦可有暴发型肝炎、i肝昏迷的临床相。本病如果以肝脏症状首发，l90％的病例均在20岁以下。肝脏损害症状可有食欲低下、i黄疸、i腹水、i下肢浮肿、i食管静脉曲张、i出血、i蜘蛛痣、i肝脾肿大、i脾功能亢进。肝脏症状的患者常被误诊为各类型的肝炎，l而肝脾肿大的患者常被误诊为原发的脾功能亢进、i血吸虫病等等。有的患者甚至做了脾切除手术亦未明确诊断。有文献报道，l被误诊的肝脾肿大的病例超过40％。并可有继发于肝损害的内分泌改变，l青春期延迟、i闭经、i流产、i男子女性乳房等。
3.神经系统症状与体征 肝豆状核变性的神经系统症状，l主要以基底神经节损害为主。神经系统损害大致分为少年型及成年型两型。少年型常起病于7岁～15岁，l以舞蹈、i手足徐动性动作及肌张力不全性动作为主，l并可有小脑性共济失调。奇怪面容、i张口流涎、i言语呐吃、i吞咽困难。上肢扭转性动作间或有快速无意识动作，l如手指的快速震颤，l下肢呈不规则的跳跃性步态。晚期有持久性、i全身性扭转痉挛，l可有痫性发作。少年型病程进展较成年型明显加快。成年型起病于1g岁～35岁，l以肌强直、i动作减少和慌张步态为主征，l可有手腕拍打样震颤及肩部扑翼震颤。并可有构音障碍，l有些患者面部表情呆滞、i瞬目减少。约在50％的患者中有小脑体征，l其中一半患者小脑体征是主要神经系统体征。体检可见肌张力增高，l亦可能波动不定。轮替动作不能，l指鼻试验可引起粗大震颤，l腱反射可亢进，l偶有伸性跖反射。感觉系统正常。丘脑下部损害时可有肥胖、i高血压、i高热等。
4.眼部症状与体征 K-F环是本病最重要的体征，l95％～98％患者有K-F环。绝大多数见于双眼，l个别见于单眼。大多出现神经症状时就可以发现此环，l位于角膜与巩膜交界处，l在角膜的内表面上，l呈绿褐色或金褐色，l宽约1.3mm，l光线斜照角膜时看得很清楚，l但早期常须裂隙灯检查方呵以发现。少数患者可出现晶体浑浊、i白内障、i暗适应下降及瞳孔对光反应迟钝等。
5.其他 大部分患者有皮肤色素沉着，l尤以面部及双小腿伸侧明显。铜离子在近端肾小管和肾小球沉积，l造成肾小管重吸收障碍，l出现肾性糖尿、i多种氨基酸尿、i磷酸盐屎、i尿酸尿、i高钙尿、i蛋白尿等。少数患者可以发生肾小管酸中毒，l并可以产生骨质疏松、i骨和软骨变性等。
【诊断和鉴别诊断】
1.诊断标准 临床诊断主要根据4条标准：i①肝病史或肝病征／锥体外系病征；②血清CP显著降低和／或肝铜增高；③角膜K-F环；④阳性家族史。符合①②③或①②④可以确诊WD；符合①③④可能为典型WD；符合②③④很可能为症状前WD；如符合4条中的2条则可能是WD。
2.鉴别诊断 本病临床表现复杂多样，l鉴别应从肝脏及神经系统两个主要方面症状及体征考虑，l须重点鉴别的疾病有急、i慢性肝炎，l肝硬化，l小舞蹈病，l亨廷顿舞蹈病，l扭转痉挛，l帕金森病和精神病等。
二、i检验诊断
实验室检查对HLD的诊断非常重要，l检验项目主要包括血清铜蓝蛋白、i血清钢、i尿铜、i肝功能、i肾功能及ATP7B基因突变检测等。
【检验项目】
1.血清铜蓝蛋白(ceruloplasmln，lCP)铜蓝蛋白是由11046个氨基酸所组成的一种糖蛋白.每一分子中含有6个～7个铜原子。它是一种氧化酶.可使二价铁氧化为三价铁、i促进转铁蛋白合成，l并可催化肾上腺素、i5-羟色胺和多巴胺等生物胺的氧化反应。在正常人血浆中，l90％～95％的铜结合在铜蓝蛋白之中，l仅少量与清蛋白或氨基酸结合，l后者是铜在血液和各组织间转运的主要形式，l电泳位于α1～α2区带之间。
(1)检测方法：i速率散射免疫比浊法。
(2)标本：i血清。
(3)参考范围：i正常人为200～400mg／L；患儿通常低于200mg／L。
(4)临床诊断价值和评价
1)HLD是一种铜代谢疾病，l因遗传缺陷，l使CP合成代谢能力降低，l导致过量的铜沉积于组织中，l特别是肝、i肾、i脑、i角膜等处，l血中CP含量明显减步。血清铜蓝蛋白检查对肝豆状核变性具有早期诊断意义。
2)血清CP含量在不同年龄、i种族及生理情况均有很大的差异。目前认为CP也是急性时相反应蛋白。血CP含量增多常见于各种病毒、i细菌、i寄生虫等引起的急慢性炎症，l恶性肿瘤如肝癌、i白血病及霍奇金病等；风湿病，l类风湿性关节炎.再生障碍性贫血，l心肌梗死，l手术，l妊娠，l口服避孕药，l经高强度训练的运动员及使用雌激素或含此类激素的药物等；胆管排泄铜受阻，l如胆汁性肝硬化、i胆结石、i肿瘤等；神经精神系统疾病，l如精神分裂症、i震颤性谵妄等。
(5)方法学评价及问题
1)终点散射比浊法是在抗原抗体反应达到平衡时进行测定，l影响因素较多，l且方法的灵敏度低、i重复性和准确性差。因此，l必须严格控制实验条件。标本内抗原含量较低时，l空白管的散射较高会使检测敏感性下降。选用本法应慎重。速率散射免疫比浊法是目前比较先进的免疫比浊法，l具有速度快、i敏感性高(达ng／L水平)、i精确度高和稳定性好的优点，l已成为目前测定特定蛋白质的主要方法。比浊法容易受各种因素的影响。
2)干扰因素：i①标本要新鲜，l无细菌污染；如不立即检测，l4℃中可保存2天，l-20℃下可保存4周，l脂血与溶血可影响测定结果；每次应做标本空白，l并用抗血清缓冲液作试剂空白；②药物影响：i雌激素与含此类激素的避孕药物酰胺咪嗪、i美沙酮、i苯巴比妥、i苯妥英钠、i三苯氧胺等可使血清CP水平升高；而天门胺酶可使其降低；③标本稀释倍数太高时，l抗原量不足，l抗体过剩，l不能形成足够的浊度，l甚至复合物分解等也导致结果偏低；④抗体要求效价高、i特异性强并且纯度高。抗体须严格处理，l可采用高速离心或0.45μm超滤膜过滤以排除干扰。长期保存须-20℃放置；⑤光的强度不仅与颗粒(散射核心)的大小和数目有关，l且与各种物理因素，l如加人抗原或抗体后的时间、i光源的强度和波长以及测量角度等均有关系。
2.血清铜
(1)检测方法：i双环已酮草酰二腙、i杂环偶氮化合物比色法和原子吸收分光光度法。
(2)标本：i血清。
(3)参考范围：i成年男性11μmol／L～22μmol／L；成年女性13μmol／L～24μmol／L；儿童5.0μmol／L～10μmol／L。
(4)临床评价和结果分析
1)铜在体内除大部分构成血浆铜蓝蛋白外，l尚有一部分铜参与构成酶的成分，l如酪氨酸酶、i单酚及多酚氧化酶、i抗坏血酸酶以及一些细胞色素分子中都含有铜。酶分子中的铜以及铜蓝蛋白所含的铜都处于不断代谢状态。铜主要经胆汁从肠道排泄，l占排出铜的85％，l尿中亦可排出少量铜，l每日尿铜排出量大约为0.15mg～O.35mg。
2)HLD疾病主要是铜代谢障碍引起的，lHLD患者铜蓝蛋白检查多数降低，l血清铜亦降低，l尿铜排出量增加。但少数病例血浆铜蓝蛋白及血清铜不降低。铜生化异常是确诊HLD的重要依据，l但并非是确诊HLD的唯一生化指标。
(5)方法学评价及问题：i双环已酮草酰二腙比色法十分灵敏，l所有试剂要求高纯度，l实验中所用仪器、i试管及一切玻璃器皿均应避免铜的污染。该方法显色稳定，l有色络合物可稳定60mm，l抗干扰能力强，l基本不受其他离子的影响。杂环偶氮化合物比色法不能用EDTA-Na2抗凝血浆，l否则将会抑制反应。
3.尿铜
(1)检测方法：i原子吸收分光光度法。
(2)标本：i尿液。
(3)参考范围：i尿液9.8μg／24h～37.6μg／24h；脑脊液107.6μg／L～112.2μg／L。
(4)临床诊断价值和评价：iHLD患者尿铜含量为200μg／24h～400μg／24h；尿铜测定主要用于HLD的诊断及其该病疗效的评价。该病患者血浆铜蓝蛋白缺乏，l故铜与具有螯合剂作用的氨基酸结合，l从尿中导致尿铜增加。青霉胺为铜的有效螫合剂，l用青霉胺治疗有效时，l尿铜的排出量可增加20倍。尿铜升高还见于尿中排出铜蓝蛋白的疾病，l如：i肾病、i肾孟肾炎和充血性心力衰竭等。24h尿铜排出增高有助于进一步确诊HLD。腩脊液中铜含量也升高，l通常在296.1μg／L～411.8μg／L，l和尿铜及血清铜含量综合分析有助于HLD的诊断。
(5)方法学评价及问题：i①原子吸收分光光度法干扰小，l凶为特定的光源只发射特定波长的光，l物质中存在的其他元素不影响测定；②受外界影响较步，l准确度和灵敏度较高，l能测定10-9g～10-6g的元素；③测定快速而且操作简便。
4.肝功能
(1)检测方法：i全自动生化分析仪根据不同检测项目的原理进行检测。
(2)标本：i血清。
(3)临床诊断价值和评价：i脑型HLD患者肝功能一般正常，l而以肝损害为主要表现的患者肝功能可出现不同程度的异常，l如丙氨酸氨基转移酶及谷氨酸氨基转移酶升高、i血清总蛋白降低、iγ球蛋白升高等。
5.肾功能
(1)检测方法：i全自动生化分析仪根据不同检测项目的原理进行检测。
(2)标本：i血清。
(3)临床诊断价值和评价；以肾脏损害为主的HLD患者尿素和肌酐可升高，l而肝功能可正常，l可籍此与肝脏损害为主的患者相区别。
6.ATP7B基因突变检测
(1)检测方法：iPCR-RELP、iDNA多态标记的染色体单倍体型分析法、iPCR-SSCP、i基因测序。
(2)标本：i抗凝全血。
(3)临床诊断价值和评价：i不同人种和地域存在着不同的ATP7B基因突变热点，l研究表明欧裔HLD患者ATP7B基因突变以存在14号外显子His1069Gln和位于18号外显子的GIy1266Lys两种突变为主，l14号外显子1069号密码子为欧洲HLD患者的高频率突变点。日本、i韩国和我国的学者研究表明8号外显子778密码子为亚洲HLD患者的高频率突变点。ATP7B基因突变形式多，l以错义或无义突变为主，lHLD患者多为复合杂合子突变，l只有少数为纯合子突变，l目前发现的ATP7B基因突变多为点突变。大量研究表明基因型和表型之间不存在明确的相关性，l但对ATP7B基因突变进行基因诊断有助于对临床可疑患者进行确诊、i婚前杂合子检出、i产前胎儿诊断都有决定性的意义。
(4)方法学评价和问题：i染色体单倍体型分析法具有简便、i灵敏度高、i对DNA模板质量要求不高、i不需酶切、i杂交即可进行多态分析和避免同位素污染等优点。由于PCR-RELP和DNA多态标记的染色体单倍体型分析法检测的不是ATP7B基因本身，l所以只能应用于存在HLD先证者的家系，l并且必须获得先证者父母的DNA资料。PCR-SSCP是目前常用的点突变初筛方法，l其检测的是ATP7B基周本身，l适用于临床可疑患者，l但PCR-SSCP也存在一些缺点，l如PCR产物片段不能太长，l否则检出率明显下降，l不适用于ATP7B基因的某些外显子。最直接、i最准确的方法是DNA直接测序法，l但该方法需DNA测序仪，l且ATP7B基因长达4.5kb，l测序存在一定的困难。
【应用建议】
1.HLD的早期诊断可选择血清CP、i血清铜及尿铜的检测。
2.确诊可选择项目：i肝铜含量的检测+血清铜的检测+尿铜的检测+脑脊液铜的检测。
3.对可疑患者的确诊可选择ATP7B基因突变检测。
4.对产前胎儿诊断应选择ATP7B基因突变检测。
5.以肾脏损害为主的HLD患者应进行肾功能的检测。
6.以肝损害为主要表现的HLD患者还应进行肝功能的检测。