一、i疾病概述
线粒体是与能量代谢密切相关的细胞器，l关系着细胞的成活和死亡。而线粒体病是指因遗传缺损引起线粒体代谢酶的缺陷，l导致ATP合成障碍，l能量来源不是而出现的一组多系统疾病。如病变以侵犯骨骼肌为主时，l称为线粒体肌病；如病变除侵犯骨骼肌外，l尚侵犯中枢神经系统，l则称为线粒体脑肌腐，l主要包括Kearns-Sayre综合征(KSS)、i慢性进行性眼外肌瘫痪(CPEO)、i肌阵挛性癫痫伴破碎红纤维(MERRF)、i线粒体脑肌病伴高乳酸血症和卒中样发作(MELAS)；若病变以侵犯中枢神经系统为主，l则称为线粒体脑病，l如Leber遗传性视神经病(LHON)、i亚急性坏死性脑脊髓病(SNE或Leigh病)、iAlpers病及Menkes病等。另外，l尚有许多中间类型。
【病因及发病机制】
线粒体病主要由线粒体DNA(mtD-NA)的突变(包括点突变、i缺失、i重复及丢失等)，l导致不能编码线粒体在氧化代谢中所必需的酶或载体，l糖原和脂肪酸等原料不能进入线粒体，l或不能被充分利用，l故不能产生是够的ATP而发生能量代谢障碍，l并产生复杂多样的临床症状。该病是母系遗传方式，l凶受精卵中的线粒体均来自卵子，l母亲将其mtDNA传递给子代，l但只有女儿可将其mtDNA传递给下一代。因每个细胞的mtDNA有多重拷贝，l一个线粒体编码基因的表型依赖于一个细胞内突变型和野生型mtDNA的相对比例，l仪当突变型达到某一阈值时，l患者的病理特征才会表现出来。
【临床表现】
1.线粒体肌病多在20岁左右起病，l临床以骨骼肌极度不能耐受疲劳为主要特征。常伴有肌肉酸痛及压痛，l但肌肉萎缩者少见。
线粒体病是一组多系统疾病，l除主要影响神经系统外，l尚影响其他系统。最易受累的组织是脑、i骨骼肌及心肌。
2.线粒体脑肌病①CPEO：i表现为单纯眼外肌瘫痪；②KSS：i表现为20岁前起病、iCPEO及视网膜色素变性等三联征，l常伴有心脏传导阻滞、i小脑性共济失调、i智能减退、i神经性耳聋等，l脑脊液蛋白含量多升高；③MELAS：i以卒中样发作为特点，l同时伴有身材矮小、i智力低下、i神经性听力下降，l血乳酸增高，l但脑脊液蛋白含量正常；④MERRF：i多见于儿童，l有明显家族史，l主要特征为肌阵挛性癫痫发作、i小脑性共济失调和四肢近端无力。
3.线粒体脑病①LHON：i好发于18岁～30_岁，l患者多为男性，l表现为由双侧视神经萎缩引起的急性或亚急性视力丧失；②Leigh病：i系先天代谢异常，l多数为散发性，l也有表现为常染色体隐性遗传或母系遗传，l男性多于女性。多在出生后3月～4月发病，l表现为喂养困难、i智能发育停滞、i吞咽困难、i全身无力、i肌张力低下、i消瘦、i锥体柬征、i视力听力减退、i眼外肌瘫痪、i眼球震颤及共济失调等，l常伴有中枢神经过度呼吸。
4.肌肉活检11可见肌细胞内线粒体堆积，l破碎红纤维(RRF)增多是特征性改变，l糖原、i脂肪也增多；肌电图多表现为肌源性损害，l少数也可呈神经源性损害；头颅CT或MRI示白质脑病、i基底节钙化、i脑软化、i脑萎缩和脑室扩大。
【诊断和鉴别诊断】
本组疾病首先应除外各种可引起线粒体继发损害的疾病，l然后根据临床特征，l结合实验室检查，l尤其是肌肉活检，l方能诊断。主要诊断依据：i①临床表现；②血乳酸、i丙酮酸最小运动量试验；③肌肉活检和电镜下发现大量的异常线粒体堆积；④线粒体生化测定证明其生化缺陷；⑤基因(主要是mtDNA)检测发现各类突变。本病需与以下疾病相鉴别：i多发性肌炎、i重症肌无力、i肢带型进行性肌营养不良、i周期性瘫痪、i心肌病、i脑卒中、i肌阵挛性癫瘸、i多发脑梗死性痴呆等。
二、i检验诊断
实验室检查对线粒体病的诊断极为关键。常规项目包括血清和脑脊液乳酸、i丙酮酸水平及骨骼肌中RRF检查，l运用分子生物学方法检测线粒体(肌肉标本、i外周血白细胞等)突变正日益成为诊断线粒体病的利器，l并为本类疾病的分类提供依据。
【一般检验项目】
1.乳酸
(1)检测方法：i比色法、i自动生化仪分析法。
(2)标本：i脑脊液、i肝素抗凝全血、i血浆。
(3)参考范围：i血浆<2.4mmol／L(比色法)、i全血<2mmol／L(自动生化仪分析法)。
(4)医学决定水平：i脑脊液乳酸浓度与全血接近，l鉴别中枢神经系统感染时，l常以3.9mmol／L为联学决定水平，l低于此值常为病毒性感染，l高于此值常为细菌性感染。
(5)临床诊断价值和评价：i乳酸为体内糖酵解的最终产物，l高乳酸血症主要由于体内组织缺氧和糖酵解速度加快，l使乳酸产量增加或肝脏对乳酸的转化功能降低。成人每天约有400g乳酸在肝内进行转化、i清除。血乳酸增高使pH值降至7135以下便出现乳酸酸中毒，l同时阴离子间隙(AG)>18mmol／L，l乳酸／丙酮酸(L／p)>15。生理性增高见于激烈运动后，l病理性增高见于组织缺氧性疾病所致乳酸酸中毒(医学决定水平为>5mmol／L)，l如休克、i酸中毒、i心功能不全、i一氧化碳中毒、i糖尿病特别是Ⅱ型糖尿病服用双胍类降糖药、i肝功能不全、i严重贫血和白血病等，l癫痫发作后和缺血性卒中血和脑脊液的乳酸含量都会有所升高。安静状态下乳酸值大于2mmol／L为异常，l特别是运动后乳酸值升高更有意义，l运动后10min不恢复正常或运动前后乳酸值对比升高4.0mmol／L以上为异常。
(6)方法学评价和问题
1)比色法：iNBT还原生成的甲臜在反应液中十分稳定，l无混浊和深沉，l吸光度久置不变，l同时加入蛋白质及表面活性剂，l可提高灵敏度和稳定性；本法线性范围达8.Ommol／L(73mg／dl)。
2)自动生化仪分析法：i血液抽出后，l为防止乳酸增加，l可将血收集于盛有碘乙酸钠试管内(不影响血凝)，l碘乙酸钠最终浓度0.5g／L，l室温下样品可稳定2h；可采用肝素抗凝血浆，l但必须将样品放在冰水中，l并且1h内分离。
3)标本采集问题：i血细胞会使葡萄精代谢生成乳酸，l标本若不马上处理，l会导致乳酸含量增高。测定乳酸的标本可用全血、i血浆或血清，l血清或血浆需离心后分离，l而采用全血需立即加入蛋白沉淀剂，l减少乳酸含量的变化。用全血和血浆均需抗凝剂，l可选肝素或EDTA，l再加入氟化钠(1.5mg／ml血)，l可抑制糖酵解。但不能用草酸盐抗凝，l因为它会抑制分析中所用的乳酸脱氢酶。推荐使用碘醋酸钠抗酵解，l它可使样品中的乳酸在室温稳定21h.尤其适合同时测定丙酮酸时。
2.丙酮酸
(1)检测方法：i分光光度计法、i自动生化仪分析法。
(2)标本：i全血、i脑脊液。
(3)参考范围
1)分光光度计法：i空腹休息状态下，l静脉血丙酮酸0.03mmol／L～0.1mmol／L(0.3mg／dl～0.9mg／dl)，l脑脊液丙酮酸0.06mmol／L～0.19mmol／L。
2)自动生化仪分析法：i<0.1mmol／L。
(4)临床诊断价值和评价：i丙酮酸增高见于各种原因所致缺氧、i酒精中毒、i细菌感染、i冠状动脉硬化、i严重肝病、i严重贫血、iⅠ型糖尿病致慢性高乳酸血症、i酮症酸中毒、iVitB1缺乏等。
(5)方法学评价和问题
1)分光光度计法：i①血中丙酮酸极不稳定，l血液抽出后半小时可下降15％～50％，l要尽可能快速地制备无蛋白血滤液。三氯醋酸、i高氯酸和偏磷酸均可作为蛋白沉淀剂，l但使用偏磷酸时NADH较稳定。上清液在室温中可稳定6天，l4℃冰箱中可稳定8天，l如冰冻可稳定42天；②采血时可以使用止血带，l因为血液淤滞2min，l其中丙酮酸盐浓度不会产生任何变化。如同时检测乳酸，l样品的留取及保存的注意事项同全血乳酸测定；③丙酮酸标准应用液必须每日新鲜配制，l因其中丙酮酸会发生聚合，l其聚合物的酶促反应率与非聚合物不同；④求乳酸与丙酮酸比值时，l应考虑方法的统一。
2)自动生化仪分析法：i本法线性范围0～1mmol／L。高浓度乳酸(40mmol／L)、i胆红素(200mmol／L)、i严重溶血(Hb12g／L)、i严重脂血标本均不影响测定结果。
3.乳酸丙酮酸运动试验
(1)检测方法
最小运动量试验：i应用自行车功量计，l于15W功率嘱患者运动15min，l于运动前后即刻及运动后5min分别取静脉血测定乳酸和丙酮酸浓度。分析运动前后三种状态下乳酸、i丙酮酸和(或)乳酸／丙酮酸(L／P)比值。
(2)标本：i全血。
(3)参考范围；L／P比值4～17。
(4)临床诊断价值和评价
1)线粒体病在运动后乳酸会升高，l但丙酮酸变化不犬，lL／P比值变化最大，l超过此值为异常。
2)L/P值是一个很重要的比值参数。从糖代谢过程看，l当乳酸脱氢酶活力正常时，l这一比值在一定程度上反映了还原型辅酶Ⅰ／辅酶Ⅰ的比值，l反映了糖代谢中酵解和三羧酸循环的比值。由于这两者都是线粒体重要的功能单位，l因此，l用血乳酸／丙酮酸值作为线粒体肌病的判断标准有较高的临床意义。
3)在某些情况下，l乳酸和丙酮酸均增高，l它们的比值基本正常，l这时用比值作为判断标准就会发生遗漏。针对此种情况，l可采用最小运动量试验中乳酸和丙酮酸测定加上两浓度比值测定的综合判定方法，l将大大提高阳性率。
(5)方法学评价和问题
1)单纯的静态血乳酸和丙酮酸测定，l检测阳性率低，l故并非作为线粒体肌病筛选的良好手段。最小运动量试验，l具有容易操作、i仪器及测定方法简单等优点，l在试验中采用综合判定的方法可达到95％以上的检测阳性率。故该法可作为筛选线粒体肌病的一种较理想的方法。
2)由于最小运动量试验是能量代谢和线粒体功能状悉的一种反映，l它只能反映出某一疾病是否可能伴有线粒体的异常。另外，l有些疾病也会造成血乳酸或丙酮酸的改变，l从而造成假阳性结果。因此，l如果得到阳性结果，l则可进一步应用生化、i电镜、i组化、i病理及临床等资料加以证实。
4.基因诊断
(1)检测方法：i线粒体的点突变基因诊断方法有：i多重PCR、i限制性核酸内切酶片段长度多态性(RFLP)、i等位基因特异寡核苷酸探针杂交(ASO)、iDNA序列测定、i变性高效液相色谱法(DHPLC)。缺失和重排(deletion1and1rear-rangement)的基因渗断方法有：iSouthern印迹、iRT-qPCR)和DNA测序。
(2)标本：i肌肉活检组织。
(3)临床诊断价值和评价
1)某些患者具有独特的线粒体损害特征，l如LHON通过对外周血单个核细胞DNA进行分子诊断即可确诊。而其他一些线粒体疾病，l则需要更复杂的检测，l包括家系调查、i血／脑
脊液乳酸含量、i神经影像学、i肌肉活检和mtDNA突变分析等方能确诊。
2)线粒体疾病可以由核DNA和线粒体DNA变异所致。实际上，l对线粒体疾病进行分类是困难的，l只凭症状很难对患者进行归类.主要是由于基因型和表型之间的差异所致。比如眼外肌麻麻痹患者都有相似的临床症状，l但是对他们进行基因分析发现，l有的患者存在大片断的mtDNA缺失，l而有的仅是存在点突变(如A3243G)，l还有的呈现常染色体显性遗传导致mtDNA二次突变(ANT1基因变异)。相同的基因突变可以导致不同的临床症状，l如A3243G点突变可以导致CPEO、i糖尿病、i耳聋、i脑卒中和癫痫。常见线粒体疾病突变类型见下表。
5.肌肉活检组织学染色
(1)检测方法：i改良Gomori三色染色法。
(2)标本：i肌肉活检组织。
(3)参考范围：i肌核紫红色，l肌原纤维暗绿色，l结缔组织亮绿色，l肌质内线粒体红色，l肌膜红色。
(4)临床诊断价值和评价：i主要用于检测横纹肌肌质内的线粒体，l在线粒体肌病和线粒体脑肌病患者横纹肌肌质内有大量的线粒体异常堆积。异常的线粒体多聚集在肌膜下，l经Gomori三色染色被染成红色.形成线粒体肌病和线粒体脑肌病横纹肌特有的病理改变——红边纤维。
(5)方法学评价和问题
1)取材注意选择肌肉为中等或轻度病变的部位，l肱二头肌、i三角肌、i股四头肌是常见的取材部位。取材时按常规外科无菌手术操作，l切取肌肉标本时动作要轻柔，l手术刀片要锋利，l不可过度牵拉或挤压肌肉组织。所取组织标本的最适大小为0。5cm×1cm×0.5cm。取材时注意纵横方向，l一般以横切为主。手术取出标本后，l要尽可能快地将标本冷冻。
2)肌肉的组织化学染色主要是测定各种酶的活性和含量，l在石蜡切片处理过程中容易将酶破坏、i因而最好做冷冻切片。肌肉组织中水分含量高，l冷冻切片制片过程中容易出现冰晶，l冰晶融化后可使组织结构发生解离造成人工假象。因此，l取材及冷冻操作过程必须十分小心。所以，l肌肉组织化学染色的成功与否，l很大程度上取决于成功的标本取材和高质量的冷冻技术。
【应用建议】
1.线粒体肌病和线粒体脑肌病过筛检验项目：i血清肌酶(如CK、iLDH等)和血乳酸、i丙酮酸。
2.肌肉活检是确诊线粒体脑肌病的重要方法，l其病理特征为肌纤维中出现RRF。
3.基因诊断：i是线粒体病今后的研究方向。