艾滋病是HIV病毒感染后导致机体免疫功能受损而出现一系列综合征，l具有潜伏期长、i病死率高的特点，l及早诊断，l不仅可给予患者及时的医疗护理，l而且对于防止HIV传播，l减少传染性都具有非常重要的意义。实验室检查是诊断HIV感染及艾滋病的重要依据，l主要包括病原学检查、i抗体检查和机体免疫功能检查等几方面。
【免疫学检测】
人体感染HIV后，l血液中最先出现HIV抗原，l然后很快消失直到疾病后期才重新出现。感染几周后出现IgM抗体并很快消失。此后，lIgG抗体出现并一直存在。因此，lHIV感染的实验室诊断以抗体检测为主，l其他方法一般作为抗体检测方法的验证和补充。HIV抗体可存在于HIV感染患者的血液、i唾液和尿液标本中，l但唾液中的HlV抗体来自口腔黏膜分秘物，l水平较低。尿液中的HIV抗体浓度也明显低于血液含量，l且个体差异较大。因此以尿液或唾液为标本测定HIV抗体的正确性明显低于以血液为标本的方法.不能正式应用于临床。故已注册批准的HIV抗体检测试剂只能用于血液标本检测。HIV抗体检测方法分初筛试验和确认试验两类，l初筛试验结果阳性者再做确证试验以明确诊断。
1.HIV抗原检测HIV抗原通常检测的是HIV-1P24抗原。P24抗原是HIV核心结构抗原，l检测P24抗原是诊断早期HIV感染的一种方法。
(1)标本采集和处理:用一次性注射器(或真空采血管)抽取一定量静脉血，l室温下自然放置1～2小时，l待血液凝固、i血块收缩后再用31000r／min离心15分钟，l吸出血清备用。用于抗原检测的标本应冻存于20℃以下。
(2)检测方法：i检测P24抗原通常采用的方法为双抗体夹心酶免疫法(ELISA)。基本过程为：i将纯化的特异性抗P24抗体包被在固相反应板孔底，l当加人待测标本后，l若标本中含有P24抗原则与包被抗体形成抗原抗体复合物，l再加人酶标记的抗P24抗体，l在抗原上又结合了酶标记的抗体，l加底物显色后，l在酶标仪上判读结果。为了提高检测血清中P24抗原的敏感性，l需先将血清中免疫复合物解离后再进行测定。目前已发展了ICD1P24抗原(immun-complex1disassociate，l免疫复合物解离，lICD)测定试剂，l用于HIV-1P24抗原测定。
P24抗原检测结果阳性，l必须经中和试验确认，l若阳性标本的OD值比中和反应前减少50％以上，l才确定为HIVP24抗原结果阳性。
(3)诊断意义及评价：iP24抗原是HIV感染后血清中首先被检测到的病毒标志，lHIV感染机体至抗体出现之前的这个时期称为“感染后窗口期”。目前用于HIV抗体检测的第三代ELISA试剂窗口期为3～4周，l在窗口期，l血液等体液中检测不到HIV抗体。P24抗原的检测大约可以使抗体窗口期缩短1周。但由于不是所有新近感染的人都可以检出P24抗原，l如P24抗原检测阴性，l只表示在本次试验中无反应，l不能排除HIV感染。加上该项检测费用较高，l所以P24抗原检测一般不作为HIV感染的常规诊断项目。P24抗原测定比抗体检测时间提前约1周可作为初期感染窗口期的早期诊断、i母婴传播HIV的早期诊断、i献血员筛选、i监测疗效和疾病预后的评估。一般采用双抗体夹心法的酶免疫技术。
P24抗原检测适用于以下几种情况：i
1)急性感染者血清HIV抗体阳转之前的诊断。
2)HIV抗体不确定的辅助诊断。
3)HIV抗体阳性母亲所生婴儿早期的辅助鉴别诊断，l在新生儿血清中检出该抗原，l可证明新生儿感染。
4)监测病程进展和抗病毒治疗效果。
5)用于献血员筛选，l提高输血安全性。
6)脑脊液中检出该抗原，l有助于艾滋病脑病的诊断。
2.HIV抗体初筛试验根据检测原理不同分为酶联免疫吸附法、i凝集法和免疫层析法等，l可对患者标本进行常规或快速检测。在实际工作中常用的有酶联免疫吸附试验、i明胶凝集试验和各种快速诊断试验等。
(1)检测方法
1)酶联免疫吸附试验(ELISA)：iELISA是最早也是使用最广泛的检测方法。其基本原理是免疫反应物通过化学或免疫学的方法形成酶结合物.酶结合物能与待检样品中相应的抗原或抗体结合成为免疫复合物，l然后加人酶底物，l经酶的催化或水解作用，l无色底物产生颜色.用肉眼、i酶标仪判读结果。初筛用的HIV1ELISA试剂目前已经发展到第四代。第一、i第二代试剂以间接法检测抗体，l第一代试剂主要以病毒裂解物或部分纯化的病毒抗原包被反应板，l由于包被的抗原不很纯，l假阳性率较高，l目前已不用。第二代试剂使用基因工程方法得到的重组抗原和合成肽包被反应板，l由于纯化抗原的使用，l特异性有了提高，l目前还有少量使用。第三代试剂使用双抗原夹心法检测抗体，l进一步提高了敏感性，l目前国内外主要使用第三代试剂。第四代ELISA试剂是最近发展起来的HIV抗原抗体联合测定试剂，l可同时检测P24抗原和抗HIV-1／2抗体。与第三代抗HIV-1／2试剂相比，l检出时间提前了4～9.1天。其优点在于能同时检测抗原抗体，l降低血源筛查的残余危险度。国际上有些国家和地区已将第四代ELISA试剂用于血源筛查。
2)明胶颗粒凝集试验(PA)：iPA是HIV血清抗体检测的一种简便方法。其基本过程是将HIV抗原致敏明胶颗粒作为载体，l与待检样品作用，l混匀后保温(一般为室温)。当待检样品含有HIV抗体时，l经抗原致敏的明胶颗粒与抗体发生抗原抗体反应，l根据明胶颗粒在孔中的凝集情况判读结果。PA操作简便，l无需特殊仪器设备，l适合对少量标本的检测。PA试剂有两种，l一种为HIV-1和HIV-2抗原共同致敏的PA试剂(AFDHIV-1／2PA)，l另一种为HIV-1、iHIV-2抗原分别致敏的PA试剂(SERODIA-HIV-1／2)，l可初步区分HIV-1型和HIV-2型，lAFDHIV-1／2PA已经我国SFDA注册批准。
3)抗-HIV金标准快速诊断：i适用于应急检测、i门诊急诊个体检测或追踪意外暴露的传染源等。它采用双抗原夹心法测定原理，l选择经纯化的基因工程制备的gp36、igp41、ip24抗原作为包被抗原和gp36、igp41基因工程抗原和P24合成肽作为胶体金结合抗原。当待测标本中含有HIV抗体时，l先与金标记抗原结合，l由于层析作用反应复合物沿硝酸纤维膜向前移动，l当遇到包被抗原时，l形成Ag-Ab-Ag-Au复合物而富集在包被线上，l形成红色沉淀线(或红色斑点)。该试验不需任何设备.迅速、i简便，l特异性较好，l且试剂稳定，l可室温长期保存。目前已有在国内被SFDA批准注册的国外进口试剂和国内产品，l一般可在10～30分钟内判读结果。
4)艾滋病唾液检测卡：i原理为酶免疫间接法。主要检测唾液中的HlVIgA与IgG抗体。具体过程为在硝酸纤维膜上包被人工合成的HlVgp41／gp36蛋白抗原，l可同时检测含在唾液中的HIV-1／HIV-2抗体，l可避免静脉穿刺。但样品预处理时间长且售价较高。ELISA艾滋病唾液检测试剂已经美国FDA批准。
5)尿液HIV抗体检测：i1996年美国FDA首次批准HIV-1尿液ELISA试剂，l我国尿液HIV抗体检测试剂正在研制。主要适用于静脉注射毒品人群和其它高危人群的大面积流行病学调查、i监测。筛查阳性者仍需采血做确认试验才能确定，l
(2)诊断意义及评价
1)初筛试剂的敏感性必须较高，l初筛试验要求能发现所有的阳性者，l不漏检。
2)初筛试剂在某些情况下可出现假阳性，l如自身免疫病、i肾衰、i肝病、i输血、i透析和接种疫苗等。假阳性的滴度往往不高。
3)HIV初筛试剂阴性反应的样品，l可由检测的实验室出具HIV抗体阴性报告；对初筛呈阳性反应的样品用原有试剂和另外一种不同原理或不同厂家的筛查试剂重复检测。如两种试剂复测均呈阴性反应，l则报告HIV抗体阴性;如均呈阳性反应，l或一阴一阳，l需送艾滋病确诊实验室确认。HIV抗体检测流程见图3-2。
3.HIV抗体确认试验HIV抗体筛查呈阳性反应的标本由于存在假阳性的可能，l必须做确认试验。确认试验方法包括免疫印迹试验、i放射免疫沉淀试验及免疫荧光试验。国内常用的确认试验方法是免疫印迹试验。
(1)检测方法
1)免疫印迹试验(WesternBlot，lWB)：i是我国卫生部颁布的“艾滋病检测技术规范”中规定的唯一的HEV-1确认方法。WB的基本原理是HIV全病毒抗原经过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE电泳)，l将分子量大小不等的蛋白带分离开来，l然后再把这些已经分离的不同蛋白带电转移到硝酸纤维索膜上。将膜切割成条状，l每一条硝酸纤维素膜上均含有经电泳分离过的HIV病毒抗原。将待检血清样品用稀释液1；100稀释，l再把它直接加到硝酸纤维素膜上，l恒温震荡，l使其充分接触反应，l血清中若含有抗HIV抗体，l就会与膜条上的抗原带相结合。加入抗人IgG酶结合物和底物后，l即可使有反应的抗原一抗体结合带呈现紫褐色，l根据出现条带情况判定结果。
HIV抗体不确定的原因：i①HIV感染早期。②非特异反应，l其他病原体的交叉反应。
处理方法：i①随访3～6个月；②检测HIV的其他指标，l如P24，lHIVRNA等。
2)免疫荧光试验(IFA)：i基本原理为用HIV感染细胞，l
该细胞内就会含有HIV抗原，l将HIV感染的淋巴细胞涂于玻片上，l固定，l制备为抗原片，l加人待检血清，l待检血清中的抗HIV抗体与抗原结合后，l再与荧光素标记的抗人IgG结合，l在荧光显微镜下可见到细胞内有黄绿色荧光。该方法可更早地检出IgM及IgG抗体，l快速且费用较低，l但有假阴性。
3)放射免疫沉淀法(RIP)：i应用竞争性结合的原理，l标记抗原和非标记抗原对特异性抗体的竞争结合反应。通过测定抗原抗体结合物的放射活性判断结果。本方法可进行超微量分析，l敏感性高，l可检测出HIV中的各种基因产物。
(2)诊断意义及评价
1)确认试验用于确定真正的HIV抗体阳性者。确认试剂必须具有高度的特异性。
2)WB检测的对象是HIV特异蛋白抗体。一般认为WB的灵敏度和特异性均比ELISA强，l其假阳性率低于1／2万，l假阴性率约为1／25万。
人体从感染HIV到能够检测到相应抗体的时期，l称“窗口期”。窗口期是HIV检测过程中涉及到的一个重要概念，l窗口期的长短依据个体免疫状态和检测试剂的不同而异。HIV感染后数周或数日内常不能检出抗体，l95％的受染者在5个月内可测出抗体。但也有感染后3～4年仍不能检出抗体者，l此时有必要检测HIV病毒。
4.免疫功能检查一般在对HIV抗体确认为阳性者进行临床分期或治疗时，l需要对患者进行免疫功能检查，l如白细胞和淋巴细胞相应功能的检测。
(1)外周血白细胞(WBC)、i血红蛋白(Hb)检测：i大多采用血液分析仪测定，l血液用EDTA-K2抗凝，l混匀后上机，l仪器自动测定WBC、iHb的值，lAIDS患者WBC、iHb均下降。
(2)周围血淋巴细胞计数采用血液分析仪或流式细胞仪检测。AIDS患者淋巴细胞数常低于1×109／L，l正常人为1.5×109／L。
(3)辅助性T细胞(CD41T细胞)、i杀伤性T细胞(CD8T细胞)检测：iHIV主要侵犯人CD41T淋巴细胞，l导致其数量上的减少和功能缺陷，l还包括NK细胞和T淋巴细胞的变化。NK细胞在抗HIV过程中，l不仅能直接攻击HIV，l还能提高CD8细胞应答。CD4值对于评价HIV感染的病期及预后极为重要，l特别是病程后期更为重要。流式细胞仪是检测CD41T淋巴细胞计数的标准方法，l可以得出CD41T细胞占淋巴细胞的比值及绝对值。AIDS患者CD4<200／μl或为200～500／μl，lCD4／CD8比值<1(正常时，lCD4／CD8比值>1.75～2.7)。
(4)β2微球蛋白测定：iHIV感染后，l单核细胞被激活或破坏，l使血清β2微球蛋白水平升高。常用放射免疫法或酶免疫法检测。AIDS患者血清β2微球蛋白>3mg／L，l若>5mg／L提示有新的机会感染。
(5)病原体检查；包括卡氏肺囊虫、i白色念珠菌、i新型隐球菌、i弓浆虫等条件致病菌的检查。AIDS患者体内可找到上述各种合并感染的病原学或肿瘤的病理依据。
【微生物学检测】
HIV病毒培养与分离从HIV感染者的细胞、i组织和体液中分离培养HIV病毒是诊断HIV感染的最可靠的依据。
(1)标本采集和处理：i一般采用K3EDTA或枸橼酸钠抗凝血，l用一次性注射器(或真空采血管)抽取一定量静脉血，l置适当抗凝剂中混匀，l再离心分离淋巴细胞备用。
(2)检测方法：iHIV仅能在人或猩猩的几种细胞亚群中增殖.常规采用外周血淋巴细胞进行病毒培养。取新鲜的健康人抗凝血用淋巴细胞分离液分离出淋巴细胞，l加人受检者淋巴细胞或经处理的其它标本共同培养，l经适当周期培养后测定培养液中HIV1P24抗原或逆转录酶活性，l进而判断患者的淋巴细胞是否受到HIV感染。
(3)诊断意义及评价：i细胞培养方法检测HIV病毒特异性很强，l一般不会出现假阳性。因为必须有一定数量的感染细胞存在才能培养出病毒来，l分离率一般为30％～60％，l其敏感性不如血清学或PCR。培养法要求严格，l且特别要防止病毒播散，l实验室必须具备严格的防护措施，l因此，l分离HIV需要在特定的P3实验室进行，l目前主要用于HIV株的保存和由HIV变异株引起的感染的诊断与研究，l故仅限于HIV中心实验室。
【分子生物学检测】
1.HIV核酸定性检测标本中是否存在HIV病毒核酸，l可在HIV抗体出现之前检测到HIV感染，l是HIV感染早期诊断的手段之一。
(1)标本采集和处理：iHIV核酸定性检测可选用K3EDTA或枸橼酸钠抗凝血，l采集的抗凝全血应在4～8小时分离外周血单核细胞(PBMC)和血浆，l否则应在24～48小时分离血浆和血细胞，l标本应冻存于20℃以下。检测HIVRNA的样品如需保存3个月以上应置于一80℃。
(2)检测方法：i通常使用聚合酶链反应(PCR)技术检测外周血淋巴细胞中HEV的前病毒DNA序列，l或用逆转录PCR(RT-PCR)法检测血浆中游离HIV的RNA。
(3)诊断意义及评价：iPCR或RT-PCR是检测特定的DNA和RNA片段，l是非常敏感的方法。其灵敏度高达100％，l但由此也产生特异性的问题。它不能作为HIV感染的常规诊断方法，l只能用于特殊情况下的早期HIV感染、i判断婴儿HIV感染，l以及血清学不确定结果的验证和补充。
1)HIV核酸定性检测适用于以下几种情况：i①早期诊断围产期感染。HIV血清阳性母亲所生的婴儿在出生后最初的6～9个月期间，l他们的血液中存在母体的抗体，l用PCR可判定婴儿是否真正被HIV感染，l如在新生儿血清中检出HIV核酸，l可证明新生儿感染；②对HIV抗体确证试验的可疑结果进一步做出诊断；③在HIV抗体产生之前(窗口期)辅助诊断急性感染；有些发达国家已将HIVRNA检测纳入血源检测项目，l以有效阻断窗口期HIV经血传播。
2)HIV核酸定性检测结果评价时应注意以下几方面：i①HIV核酸检测阴性，l只可报告本次实验结果阴性，l不可排除HIV感染；②HIV核酸检测阳性，l只能作为HIV感染的辅助诊断指标，l不能单独用于HIV感染的诊断；③报告核酸定性检测结果时应注明反应条件和所使用的引物序列。
2.病毒载量(Viral1Load)检测HIV核酸定性检测只能检测标本中是否存在病毒核酸，l病毒载量检测是定量检测标本中病毒复制水平。结果以每毫升人体标本中检测出病毒核酸拷贝数来表示。
(1)标本采集和处理：i一般采用K3EDTA或枸橼酸钠抗凝血，l根据检测方法要求处理标本。
(2)检测方法：i病毒载量的主要检测方法有以下几种。
1)逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)：i标本抗凝后，l要求6小时之内分离血浆，l运输前在20℃或一70℃玲冻。采用该法可定量检测标本中HIV1RNA，l利用逆转录反应将RNA转录为eDNA，l再以eDNA为模板进行PCR扩增。扩增产物鉴定同普通PCR。
2)分枝DNA信号扩大系统(bDNA)：i标本抗凝后，l要求4小时之内分离血浆，l运输前在一20℃或一70℃冷冻。该法用于定量检测标本中HIV1RNA。
3)核酸序列扩增系统(NASBA)：i即等温RNA扩增系统。
4)实时荧光定量PCR检测技术；标本采集和处理同普通PCR，l在PCR反应体系中加入荧光基团，l利用荧光信号实时监测整个PCR进程，l最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。
(3)HIV病毒载量检测结果报告时应注意以下几方面。
1)按照仪器读数报告结果，l应注明使用的试验方法、i标本种类和标本量。
2)测定结果小于最低检测限时，l应注明最低检测限水平。
3)低于最低检测限的结果不能排除HIV感染。
4)检测结果报告中应附上仪器打印的数据。
(4)诊断意义及评价。
1)用于预测疾病病程和监测抗病毒治疗的疗效与病毒水平：i高病毒载量预示病程快速发展。
2)监测疗效有效的抗病毒治疗应该能够显著降低病毒载量。
3)早期辅助诊断：i可在其他血清学和病毒学标志出现前检出病毒核酸，l也可判定无症状，l而血清阴性患者潜在的HⅣ传染性。
4)发现病毒耐药性产生，l进一步对耐药基因序列分析，l指导临床选择治疗药物。检测HIV载量有上述用途，l但只能在有条件的实验室进行检测且实验费用昂贵，l不适于常规使用。
3.基因检测主要采用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)、i分枝DNA信号扩大系统(bDNA)、i核酸序列扩增系统(NASBA)等技术扩增HIV基因。再通过测定基因序列，l判断病毒变异情况。
4.HIV不同亚型的测定主要采用分子杂交试验和序列分析技术对HIV-1毒株不同亚型而进行的测定。目前我国已发现至少有A、iB、iC、iD、iE、iF16个亚型。
5.抗病毒治疗的耐药监测11HIV耐药性的产生是导致艾滋病抗病毒治疗失败的重要原因，lHIV耐药分为原发性和继发性两种，l前者指那些直接影响抗病毒药物作用靶点的变异，l具有药物特异性，l可降低抗病毒药物敏感性；继发性变异又称为补偿变异，l常出现于原发性变异已存在的病毒基因组中。HIV耐药性的监测对指导临床用药及预防耐药株的播散起着非常重要的作用。耐药性检测有两种方法，l即表型检测及基因型检测。
(1)表型检测
1)检测方法：i首先从患者体内分离病毒，l与待检药物共同培养，l然后测定不同药物浓度下外周血单个核细胞(PBMC)所产生的P24抗原量，l根据其剂量，l反应曲线得到50％抑制浓度(IC50)，l与标准参比毒株的IC50相比以确定对药物的敏感性。
2)检测意义及评价：i①从患者体内直接分离病毒制得高滴度的毒株进行药敏试验，l能够比较直观地反映病毒株对药物的敏感情况；②操作步骤复杂，l技术要求高，l费用昂贵，l耗时，l整个过程至少需6周时间；③病毒分离培养过程还有可能发生变异。
(2)基因型检测
1)检测方法：i先经RT-PCR技术扩增HIV的蛋白酶和逆转录酶基因序列，l然后用分子杂交或核酸测序证实所扩增片段中是否存在耐药突变。以分子杂交为基础的基因型分析法所扩增产物较少，l敏感性较高，l但只能检测有限的突变位点。直接对RT-PCR产物进行基因测序能提供较为全面的耐药突变信息。
2)检测意义及评价：i①基因型检测的费用较低，l技术相对容易；②可在样品收集后1～2周得到结果；③分析基因型耐药检测时，l需要掌握大量相关知识，l才能对结果进行正确的分析。
【检验诊断综合评价】
HIV感染的实验室诊断主要取决于于血清学试验。分子生物学检测等试验则用于HIV型别流行区域分布、i药物疗效、i耐药性监测等流行病学调查或作为血清学试验的完善和补充。
1.HIV感染的确认主要取决于血清HIV-Ab的检出。在筛选试验(ELISA)阳性的基础上进一步采用确认试验(WB)检出HIV-Ab。
2.AIDS的诊断血清HIV-Ab阳性又具有下述任何一项者。如外周血CD4+T细胞数降至200／μl甚至50／μl，l机会感染或Koposi肉瘤、iB淋巴细胞等恶性肿瘤以及神经系统如艾滋病性痴呆等。
【注意事项】
1.酶免疫印迹技术要求与初筛试验相似的灵敏度及更高的特异性。
2.判断是否感染HIV应十分慎重，l在出现不确定或可疑结果，l应进行随访监测，l并结合其他病原学或分子生物学诊断指标做出正确的判断。
3.酶免疫印迹技术应严格按标准化要求进行操作，l并作好质量监控。