泌尿生殖道支原体感染的实验室诊断方法有支原体的分离培养、i血清学鉴定等.包括代谢抑制试验(MIT)、i生长抑制试验(GIT)以及快速诊断试验。快速诊断试验包括抗原检测、i核酸检测等。常用的方法有反向间接血凝试验、i间接免疫荧光试验、i酶联免疫吸附试验(ELISA)以及核酸杂交、i多聚酶链反应(PCR)等分子生物学诊断。目前，l对于男、i女性非淋菌性尿道炎或宫颈炎中支原体感染的实验室诊断，l大多采用分离培养，l留取初次培养阳性的菌株进一步采用PCR予以菌株鉴定，l详见支原体检验诊断程序(图9-2)。
【分离培养】
分离培养是Uu、iMh、iMf和MPe等支原体感染实验室诊断的金标准。Uu、iMh、iMf、i和MPe虽然均可在人工培养基上生长，l但营养要求高，l需供给胆固醇、i酵母和马血清(亦可以无支原体污染的胎牛血清替代)。国外常用PPLO制备相应培养基，l而我国亦有报道猪肺消化汤作为基础培养基，l补充10％～20％马血清和酵母液、i0.5％氯化钠，l适量加青霉素抑制杂菌。
1.标本的采集
(1)尿道分泌物：i①无菌拭子小心插入患者尿道2～4cm，l旋转数周后取出；②女性患者通过阴道内压迫尿道或向前按摩，l使分泌物溢出。
(2)巴氏腺、i尿道旁腺分泌物：i局部消毒后压迫腺体使分泌物溢出，l无菌拭子蘸取。
(3)阴道、i宫颈分泌物：i用窥器扩张阴道，l用灭菌拭子采取阴道或宫颈口1～2cm处分泌物，l在取宫颈标本时，l应先用拭子将宫颈揩干净，l再用另一个拭子取材。用拭子取材时，l要在官颈(或尿道)内旋转并停留30秒以上，l以便获得更多的细胞。进行分离培养和涂片镜检。
(4)宫腔分泌物：i怀疑有急性宫腔内支原体感染时，l原则上不采取宫腔分泌物，l以免感染扩散，l必要时用灭菌导管抽取，l导管外套一层护膜，l经宫颈插入官腔后再刺穿保护膜抽取分泌物。
(5)前列腺按摩液：i清洗尿道口，l用前列腺按摩法采集前列腺液，l用无菌容器收集。
(6)精液：i受检者应5日以上未排精，l清洗尿道口，l采用手淫或体外排精法，l射精于灭菌容器送检。
(7)尿液：i如果必须用尿液作支原体培养，l可留取清晨前段尿10～20ml，l41000r／分钟离心3分钟，l倾去上清液，l取沉淀物约0.2ml接种，l尿液作支原体培养的阳性率明显低于尿道或宫颈分泌物。
(8)组织标本：i可疑为生殖道支原体感染导致不良妊娠(自然流产、i早产、i低体重患儿和胎膜早破)的胎盘组织、i脐带或羊膜标本。
上述采集标本后同时涂片，l革兰染色、i镜检，l一并进行淋球菌培养和衣原体抗原检测，l以排除淋球菌和沙眼衣原体感染。所采集的标本需及时送检。
2.培养基
(1)液体基础液体培养基：iUu的液体培养基含0.1％尿素，lpH6.0～6.5；Mh液体培养基含0.1％精氨酸，lpH7.0～7.3。
(2)Uu和Mh液固体培养基：i液体培养基中加入1.2％～1.5％琼脂粉。
3.Uu和Mh的分离培养
目前已公认Uu、iMh、iMg、iMf和MPe与生殖道感染相关，l而且Uu、iMh亦被证实与不良妊娠相关，l近年来已发现Mf可导致新生儿败血症，lMPe与新生儿呼吸道感染相关。因此，l也可取过滤液体同时接种Uu、iMh和SP-413种液体培养基。
(1)结果分析：i根据Uu和Mh在液体培养基生长特性(pH、i分解尿素、i精氨酸、i培养所需时间等)排除L型细菌生长(表9-1)，l再根据菌落特征，l及临床症状如尿道炎、i阴道炎等即可作出鉴定。结果判断见下表。
(2)注意事项
1)标本采集后须立即接种，l不能让拭子干燥，l暂不能接种者需置于保存液中低温保存，l但不能超过48小时。
2)提倡过滤接种，l以避免杂菌混人污染，l导致假阳性或干扰支原体生长。
3)一旦发现培养基变色，l应及时接种普通培养基以排除L型细菌(表9-2)的同时接种支原体固体培养基或回收菌株置-20℃保存，l以免菌株在液体培养基中因菌体自身代谢导致培养液的pH改变而死亡，l最终在固体培养基上出现假阴性结果。取回收菌株进一步进行菌种、i耐药性的鉴定。
4.Mg、iMf和MPe的分离培养Mg是近年来发现与生殖道感染相关的病原体。MPe和Mf是近年来从HIV感染着体内分离并进一步证实具有致病性的人类支原体，l叉称为AIDS相关支原体。比较可行的是，l初代培养阳性过滤除菌后采用PCR进一步鉴定。目前国内市场无Mg、iMf和MPe相应抗血清予以血清学鉴定，l因此，l初代培养阳性过滤除菌后的培养物采用PCR进一步鉴定，l采用套式PCR方法检测16srRNA基因成为目前Mf、iMPe和Mg感染的辅助实验诊断手段。
【生物学鉴别】
在分离鉴定过程中，l必要时，l阳性培养物还需分别取过滤培养物0.2ml接种生化管(葡萄糖、i尿素、i精氨酸)进行底分解物试验初筛，l泌尿生殖道五种支原体生物学特性鉴别见下表。
生殖道支原体感染的实验室诊断除了在各自分离培养的基础上还需进一步进行生化试验初步鉴别的基础后若仍不能鉴别可取培养后的滤液(不含有细菌的污染物)采用PCR进一步进行Uu、iMh、iMg、iMf、iMPe基因诊断。目前Mg、iMf、iMPe血清学鉴定还不能开展。
【血清学鉴定】
1.Uu的血清型别鉴定由于大多数Uu菌株可以是正常泌尿生殖道正常菌群，l只有少数血清型(如Uu4型、i1、i5和8型等)与泌尿生殖道的感染以及导致不孕、i不育、i宫内感染等不良妊娠相关，l因此，l有必要时，l还需进行Uu的血清型别鉴定，l常用的方法有代谢抑制试验(MIT)和生长抑制试验(GIT)。
(1)代谢生长抑制试验(MIT)：i即液体法，l将Uu接种至含有相应型抗血清(1～14血清型)与酚红和尿素的液体培养基，l并与不含抗血清相比较，l因抗血清抑制相应型的Uu生长而表现为培养基不改变颜色，l提示与其中的抗血清相对应。若孵育后，l培养基变为红色提示Uu生长，l并提示与其中的抗血清不对应。但是首先观察不含抗血清的对照试管是否生长，l只有在不含抗血清对照管生长的情况下，l即液体培养基变为红色，l然后根据试验管不生长或生长，l判断试验菌株与其中的抗血清是否相对应。
(2)生长抑制试验(GIT)即琼脂扩散法：i即将待检的支原体接种到固体琼脂平皿上。然后再用浸过适量特异型别的抗血清的滤纸放到琼脂表面，l观察支原体生长是否受到抑制以判断Uu的血清型，l并与不含抗血清者相比较。
2.Mh的血清学鉴定Mh的血清学鉴定方法同样包括代谢抑制试验(MIT)和生长抑制试验(GIT)。Mh至少有7个血清型。
(1)代谢生长抑制试验(MIT)：i即液体法，l将Mh接种于含有特异性抗血清的液体培养基中与不含抗血清相比较，l若与其中的抗血清相对应，l即其中的支原体生长代谢被抑制，l而表现为培养基中的酚红不变色。
(2)生长抑制试验(GIT)：i即琼脂扩散法，l若生长抑制试验(GIT)则是将吸附有特异性Mh抗血清的滤纸置于接种有Mh的固体培养基上，l孵育后，l菌落周围若见抑菌环，l提示该支原体与所用的抗血清同型。
【药物敏感性试验】
在我国重点防治的性传播疾病中，l2000年非淋菌性尿道(宫颈)炎(NUG)报告的病例数已上升至第二位，l近年来，lUu和Mh对抗生素的耐药性问题已引起多方注意，l滥用抗生素可能是导致支原体耐药的重要因素。有报道.Uu对四环素的耐药株占10％～20.6％，l对多西环素的耐药株占8％～27.5％，l对红霉素的耐药株占10％～52.4％，lUu和Mh对氧氟沙星的耐药株占近20％。此外，l对罗红霉素及阿奇霉素的耐药株也有报告。由于支原体对抗生素的耐药性有日渐增加的趋势，l临床用药时应予以注意。有专家主张在治疗支原体感染时，l为了减少或防止耐药株的出现，l宜采用2～3种不同类型的抗生素联合治疗。同时，l还可给予中药辅助治疗，l但尚未发现治疗支原体的特效中药。
目前，l支原体的感染的确诊主要依赖于分离培养，l由于感染人数的众多及治疗的不规范，l其耐药性也不断增强，l因此，l将支原体的分离培养并及时进行药物敏感性测定，l根据药敏结果合理地用药治疗，l是NUG防治工作中极为重要的手段。而且，l浸泡过抗菌剂的纸片法(细菌药敏试验)不适用支原体药物敏感试验。目前，l比较公认的还是最低抑菌浓度(MIC)法。目前已在临床进行药物敏感试验的是Uu和Mh两种支原体。
【注意事项】
1.微量法试验中所有试验和对照均建立复孔。
2.进行药物敏感性试验之前应预测试验菌株的CCU(生长旺盛期，lUu一般为10-7，lMh为10-8～10-9)或CFU。
3.被试验药物的敏感和耐药范围应设有标准的质控菌对照。
【免疫学检测】
在不必做Uu或Mh分离培养的情况下为了测定患者是否测Uu或Mh感染，l国外介绍可用敏感的免疫学方法检测标本中有无Uu或Mh抗原，l常用的方法有反向间接血凝(RPHA)、i免疫斑点试验(IDT)间接免疫荧光法(IIF)和酶联免疫吸附试验(ELISA)等。虽然这些方法快速、i敏感、i特异性高、i准确，l但目前我国缺乏相应试剂盒，l未能应用临床。
【分子生物学检测】
人体支原体在体外培养对培养基的营养要求很高，l且生长缓慢，l临床标本中含量偏低，l且存在污染等问题.因此分离培养诊断阳性率较低.不能适应临床诊断的要求。虽然，l随着分子生物学技术在生物医学各领域的应用已非常广泛.已建立各种支原体的基因诊断文库，l然而，l由于支原体属内各种间某些基因存在同源性以及共同抗原的存在等原因，l导致利用DNA探针和血清学方法对支原体诊断常有交叉反应，l敏感性高而特异性不高。于是专家建议，l在分离培养的基础上用聚合酶链反应(PCR)予以鉴别各种支原体，l其敏感性、i特异性均较高。
(1)标本处理：i取材部位为子宫颈管，l男性为尿道。将灭菌白金耳深入官颈管或尿道1cm左右，l转动数圈，l停留约30秒，l取出后置标本缓冲液中。
(2)经支原体DNA提取，lUu、iMh、iMg、iMpe和Mf引物的设计，l扩增产物的检测。
【检验诊断综合评价】
虽然，l由于支原体具有生长速度缓慢，l导致分离培养、i鉴定的过程需较长时间，l但是，l支原体的分离培养仍是支原体感染检验诊断的金标准。临床要求对生殖道支原体感染者早期确诊，l及时治疗，l防止传播，l主要方法有分离培养、i抗原检测、i血清学试验和分子生物学方法。如PCR或基因探针技术使得支原体检测简便、i快速、i敏感、i特异，l为支原体的检测和研究开辟了一个广阔前景。由于分离自泌尿生殖道的支原体中因Uu和Mh在各自液体培养基上生长，l若固体培养基见“油煎蛋”样菌落。并根据相应临床症状即初步可确诊。同样分离自泌尿生殖道标本若在SP-4液体培养基中产酸而不浑浊，l亦无L型细菌生长时拟诊为Mf、iMPe和Mg，l但采用底物分解试验不能予以鉴别(或需要时问)。因此，l建议在支原体的液体分离培养后过滤、i转种见油煎蛋样菌落的基础上再取可疑菌株结合多聚酶链反应(PCR)进一步鉴定菌种，l此方法既可以避免不便在临床使用的、i烦琐的常规鉴定.又可避免因PCR操作不小心或细菌污染导致的假阳性。但是，l商业化泌尿生殖道支原体培养、i鉴定和药敏试剂盒仅提供Uu和Mh的液体培养基，l并由于没有进行固体培养或过滤转种鉴定，l也只能作为泌尿生殖道支原体(Uu和Mh)的过筛试验，l以此判断支原体感染，l将有20％的假阳性或20％的假阴性(其他支原体并没有得到筛查)，l且不能鉴别为何种支原体；又由于取材没有定量，l结果可靠性差，l特别是经过规范治疗后解脲脲原体培养仍长期阳性者，l无可解释。为开展对支原体感染流行病学监测、i防止致病性支原体菌株的爆发流行，l在进行分子生物学快速诊断的同时仍须采用分离培养技术并结合血清学试验应用于支原体流行病学的调查研究。
【注意事项】
支原体的检验诊断要注意PCR或基因探针技术虽然敏感、i特异，l但易出现假阳性结果，l因此，l要注意克服实验污染。结合临床症状予以诊断并建议复查。