目前，l诊断软下疳尚无可靠方法，l临床标本的杜克雷嗜血杆菌培养仍是确诊该病的手段，l但敏感性约为75％，l且该菌培养困难、i营养要求高而复杂，l所以临床实验室不易开展。不过，l随着各种现代诊断技术的发展，l软下疳的非培养诊断法也随之逐步兴起，l这可能对软下疳的早期诊断很有帮助。
【微生物学检测】
1.直接涂片法清洗软下疳溃疡，l除去脓性分泌物及其中的杂菌，l然后从溃疡或横痃处采取标本涂片，l进行革兰和Giemsa染色显微镜下观察。如见有革兰阴性短链杆菌(彩图10-1)，l沿着黏液丝平行排列呈“铁轨”状或以更复杂的方式呈“鱼群状”或“指纹状”排列，l可考虑为杜克雷嗜血杆菌。但涂片法敏感度不高，l阳性率约为50％，l且溃疡中其他革兰阴性菌也影响观察，l所以本法不能作为软下疳的确诊依据。虽然直接涂片法尚不能作为确诊方法使用，l但仍有学者认为，l杜克雷嗜血杆菌是可以根据其独特的形态学特点来确定的。
2.培养法本法为软下疳确诊的“金标准”。杜克雷嗜血杆菌对营养要求较高，l不易培养。常用培养基有Columbia血琼脂培养基、i淋球菌胎牛血清琼脂(含牛血红蛋白、i胎牛血清、i万古霉素、i氨基酸)、iMueller-Hinton琼脂培养基或兔血琼脂培养基。取标本时应去除溃疡表面的痴皮和碎屑，l用灭菌拭子采集分泌物和溃疡基底部物质。如标本采集后不能及时检验，l应立即接种于运送培养基(BM-SGA运送培养基)，l4℃可保存4日左右。标本接种后，l置5％～10％C02环境中，l35℃培养24～48小时。本菌菌落如针尖样大小，l光滑、i凸起、i非黏液样、i半透明、i浅灰色或黄灰色、i不粘连。菌落内细菌排列紧密，l推之，l可在培养基上滑动。符合杜克雷嗜血杆菌苗落特征的细菌，l还必需再进行涂片染色镜检和生化反应(如氧化酶、i硝酸盐还原、i辅酶I和氯化血红素、i碱性磷酸酶、i过氧化氢酶、i尿素酶、i吲哚、i糖利用等试验)加以鉴定。由于不同菌株对营养的要求不同，l如同时运用两种不同的培养基进行培养，l将有助于提高阳性率。
【免疫学检测】
1.抗体检测检测血清中杜克雷嗜血杆菌抗体的方法有皮肤试验(Ito’s1reaction)、i酶免疫测定、i补体结合试验、i凝集试验以及间接荧光抗体试验等多种，l可用于软下疳的流行病学调查。皮肤试验原理与结核菌素试验相似，l于皮内注射48小时后，l如产生的红斑直径≥10mm即认为阳性。软下疳伴有横痃的患者几乎100％阳性；已治愈的患者多数仍呈阳性反应，l甚至终身阳性；潜伏期内皮肤试验可能阴性，l经1周后再次复查仍为阴性者可排除本病，l阳性则应考虑感染的可能；不过该试验尚缺乏是否可出现假阳性的可靠报道。酶免疫测定、i补体结合试验、i凝集试验及荧光抗体间接试验等(抗原可为细菌超声裂解物、i外膜蛋白或脂寡糖)均可通过血清学检查检测到杜克雷嗜血杆菌感染产生的抗体，l但尚未推广，l目前认为IgM抗体敏感性低于IgG抗体，l而其特异性高于IgG。
2.抗原检测利用杜克雷嗜血杆菌29kD外膜蛋白及其脂寡糖制备单克隆抗体，l用该抗体进行免疫荧光试验检测生殖器溃疡患者标本，l报道显示具有较好的敏感性，l但特异性一般.可用于软下疳的流行病学调查，l不过价格较高，l不适于低流行区直用。杜克雷嗜血杆菌血红素受体的单克隆抗体，l诊断本病可在15min获得结果，l且特异性很高.但敏感性欠佳。
【分子生物学检测】
1.多重PCR研究显示，l聚合酶链反应技术(PCR)是一种检测杜克雷嗜血杆菌的敏感方法。可扩增的序列有；16S1rRNA基因序列、irrs(16S)-rrl(23S)rRNA基因间隔序列、i编码GroEL热休克蛋白的基因序列及无名的DNA片段等，l敏感性和特异性都较高。如使用标记的DNA探针和寡核苷酸探针进行Southern杂交检测，l敏感性会更高。现有商品化的多重PCR，l可从单个拭子标本中同时检测杜克雷嗜血杆菌(编码47-kD外膜蛋白)的基因。
对杜克雷嗜血杆菌DNA中编码47-kD外膜蛋白的基因的检测,1有望对生殖器溃疡病的诊断产生根本性的改变。针对杜克雷嗜血杆菌DNA的分型技术(核糖体RNA1Hind1Ⅲ内切酶的限制性片段长度多态性分析和质粒分析)，l也可能成为其行病学调查的有力手段。另外，l杜克雷嗜血杆菌外膜蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析也为软下疳的流行病学调查提供了一个有效手段。
2.质谱分析11基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱，l目前已成功运用于杜克雷嗜血杆菌的蛋白分析，l可在10分钟内获得结果，l能够进行该菌的快速鉴定及区别不同分离株间的差异。不过本法所有仪器昂贵，l仅能用于及少数大型实验室。
3.组织病理检查组织病理显示3个带，l上层为溃疡底部，l较狭窄，l可见中性粒细胞、i纤维蛋白、i坏死组织和革兰阴性杆菌；中层较宽，l有血管内皮细胞增生、i血管腔闭锁、i血栓形成;下层为浆细胞和淋巴细胞侵润，l位于真皮深部。对软下疳患者原则上不推荐进行组织病理检查，l但对于排除难治性溃疡或非典型性溃疡的恶性变，l本法意义较大。
【检验诊断综合评价】
虽然，l杜克雷嗜血杆菌至今分离培养困难，l但是，l根据病史、i症状，l腹股淘溃疡横痃中脓液革兰染色，l镜检见链杆菌以及梅毒血清学试验阴性有诊断意义。免疫学和分子生物学检测仅为辅助诊断。