【微生物学检测】

1.直接涂片法

(1)9g／L氯化钠溶液涂片法：i取女性阴道、i宫颈分泌物或阴道壁上乳白色薄膜，l制作9g／L氯化钠溶液涂片，l显微镜检查。如见有卵圆形孢子和假菌丝，l即为阳性。如发现假菌丝较多，l说明念珠菌处于致病阶段，l对诊断更有意义。

(2)氢氧化钾涂片法：i取10％氢氧化钾溶液1～2滴，l于载玻片上与患者生殖道分泌物制成涂片，l显微镜下观察。男性患者可取阴茎龟头、i冠状沟或包皮处皮损表面皮屑与氢氧化钾溶液混合制成涂片，l并于火焰上稍稍加热，l促使上皮细胞软化，l便于观察。在高倍镜下，l如见到绿色折光的酵母样菌或假菌丝，l即为阳性。这两种方法操作方便，l但诊断的敏感性仅有50％～70％左右，l且阴性结果不能排除本病。

(3)革兰染色法:按照上述方法采取标本制作9g／L氯化钠溶液涂片，l自然干燥、i火焰固定后行革兰染色，l油镜下观察。如见有革兰阳性的紫色孢子和假菌丝，l则为阳性。本法阳性率高于非染色涂片镜检法，l并有助于与其他微生物鉴别，l可作为诊断的依据。

2.分离培养将采取的标本接种沙保弱培养基，l30℃培养24～48小时。如有白色、i圆形、i有光泽的奶酪样小菌落生长，l挑取少量菌落涂片，l直接镜检或革兰染色镜检，l见有大量孢子，l即可初步诊断为念珠菌感染。随后再行芽管生成实验、i厚膜孢子形成实验及部分糖同化试验等检测，l确定为何种致病性念珠菌。沙保弱培养基是一种选择培养基，l其pH值小于6.0，l可以抑制多种细菌的生长。另外培养基中还含有抗菌药物(氯霉素和庆大霉素最为常用)也可抑制其它细菌的生长。

当前，l可在分离培养基中加人检测某些念珠菌的菌种特异性酶的底物，l在菌种分离的同时直接进行鉴定。其原理是人工合成底物由产色基团和微生物可代谢物质(如糖苷类、i氨基酸或肽类)两部分组成，l通常情况下底物为无色。在特异性酶作用下游离出产色基团并产生荧光或显示一定颜色，l用紫外灯观察菌落产生的荧光或直接观察菌落颜色即可对菌种做出鉴定。白色念珠菌是临床标本中最常见的酵母样真菌。Dalton等报道，l用4-甲基伞形酮-N-乙酰-β-D-氨基半乳糖苷(4-methy-lumbelliferyl-N-acetyl-β-D-agalactosaminide，l4-MUAG)测定白念珠菌N-乙酰-β-氨基半乳糖苷酶(NAG酶)，l通过观察产生的蓝色荧光可快速鉴定白色念珠菌，l敏感性和特异性都达100％。目前以4-MUAG为底物直接鉴定白色念珠菌的商品化培养基鉴定白色念珠菌的正确率都在98％以上。以化学产色基团为底物，l对临床标本检测显示，l培养72小时可鉴定90％以上的白色念珠菌，l特异性达100％。CHRO1magar1Candida培养基则含多种底物，l可对白色念珠菌(为翠绿色)、i热带念珠菌(为蓝灰色)、i克柔念珠菌(为粉红色)进行直接鉴定，l培养48小时对此3种念珠菌鉴定的特异性和敏感性均超过99％。

【免疫学检测】

胶乳凝集法(latex1particle1agglutination，lSLA)可检出某些念珠菌。原理为胶乳偶联的抗体可与念珠菌表膜的酵母甘露聚糖结合发生抗原抗体反应，l从而产生凝集。方法为，l将I滴抗念珠菌多克隆抗体胶乳在玻片上，l并与阴道分泌物混和磨匀，l如有凝集出现即为阳性。本法特异性高，l速度快(小于3分钟)，l敏感性尚可，l但尚未广泛应用于临床。对于全身性念珠菌感染，l也可通过血液中的抗原和抗体检测辅以诊断。到目前为止，l研究的有48-kD胞浆抗原(念珠菌烯醇酶抗原)的脂质体免疫测定、i甘露聚糖抗原的胶乳凝集试验检测、i抗48-kD胞浆抗原抗体检测、i抗甘露聚糖抗体的ELISA检测、i血清抗体的念珠菌-斑点间接免疫荧光实验检测及细菌代谢物阿拉伯树胶酸和甘露糖的气液相色谱检测等。也有学者研究通过检测生殖器念珠菌病患者血液中抗甘露聚糖抗体以辅助诊断，l并显示出了78％的敏感性和90％的特异性。但大多数临床工作者认为，l血清学检查对生殖器念珠菌病的诊断没有意义，l所以也没有建议使用这些试验。

【分子生物学检测】

近年来，l分子生物学技术已广泛应用于念珠菌和念珠菌病研究，l突出表现在念珠菌的分类鉴定和念珠菌病诊断研究方面。

1.分子生物学分型方法

(1)DNA中G+C1mol％含量测定：i本技术目前已较为成功的应用于酵母菌的分类鉴定上。即利用真菌DNA中核酸序列的同源性及基因大小相似性的遗传特征，l测定DNA中的碱基含量(G+C1mol％含量)作为真菌分类鉴定的重要遗传指标。

(2)核酸杂交技术：i包括DNA-DNA杂交分析、iDNA-rRNA杂交分析、i核酸分子探针杂交等。一般在相同的菌种中，lDNA-DNA杂交的成功率高达80％以上.若低于20％基本可考虑为无关菌系，l65％～80％之间的菌有较多的同源性，l提示为同一属的不同种。但如结果在20％～25％范围时则难以作出判断，l应并用其他方法分析确定。由于rRNA具有高度的保守性，l所以对属或属以上水平的分类则应采用DNA-rRNA杂交。

随着DNA研究的深人.在真菌分类领域DNA探针的应用日趋广泛。真菌DNA探针大致可分成两类：i①种特异性探针：i主要用于鉴定真菌菌种；②多态性探针：i从来源上来分，l真菌多态性探针分为基因组DNA多态性探针、i线粒体DNA(mtDNA)多态性探针、irDNA多态性探针、i微(小)卫星重复序列DNA探针等。在酵母菌方面，l基因组多态性探针的研究较多。进展最快的为Ca3、iCa5、iCa7、iCa24探针系列。Ca3为白色念珠菌种内多态性探针，lCa7为念珠菌属内多态性探针，l它们形成的杂交带数目适中、i清晰、i稳定性高，l具有良好的分辨力和稳定性。微(小)卫星重复序列探针具有序列简单、i便于人工合成、i易于标准化和便于比较等特点，l是一种很有前途的探针。

(3)限制性酶切片段长度多态性分析：i限制性酶切片段长度多态性(RFLP)，l是指在生物进化进程中，lDNA碱基序列发生插人、i缺失或突变，l从而改变了限制性核酸内切酶(RE)的识别位点。因此，l同种生物不同个体的DNA分子用同一种RE酶切，l会产生不同长度的片段，l在凝胶电泳时呈现不同的带型。RFLP的研究对象是基因组DNA和线粒体DNA。原则上只要内切酶选择合适，l对所有真菌均能显示任何分类水平上的多态性和特异性，l常用于种以下的分类。

RFLP技术方法简便，l影响因素少，l稳定性高。

(4)电泳核型分析：i电泳核型(EK)是指细胞中的染色体在一定电场作用下在固体包埋物中的排列情况，l反映了染色体的大小、i数目和形状的差异。它需要昂贵的仪器，lDNA的制备及PFGE过程也均较费时。

(5)多位点酶电泳：i多位点酶电泳(mutilocus1enzyme1electrophoresis，lMEE)是一种表型分子生物学分类方法。用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，l将蛋白质从细菌溶解物中分离出来，l以特异性酶活性染色法染色，l观察各酶的移动情况。常被检测的酶有乙醇脱氢酶、i葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、i谷氨酸脱氢酶等活性较高的酶。根据各酶的电泳迁移率，l计算待检真菌间的相似系数。此法可靠方便，l分辨力尚佳，l重复性好，l便于不同实验室对不同批次结果的比较。

(6)随机扩增多态性DNA(RAPD)分析：i随机扩增多态性DNA分析是一种利用随机合成的单个寡核苷酸引物通过PCR反应扩增靶细胞DNA，l扩增产物经凝胶电泳，l分析DNA片段大小和数量多态性，l从而比较靶基因差异的一种技术。

任何一种好的分类学技术指标仍不能单独用于物种分类，l必须结合多个可靠的分类指标，l如形态性状、i生理性状、i生化特点及基因水平的指标综合考虑。在此基础上才可能建立符合客观规律的自然分类系统。应正确处理表型研究和基因型研究间的关系，l两者的关系似应为表型鉴定、i基因型证实。基因型是菌种之间存在差异的物质基础，l表型是使菌种鉴定得以在常规临床实验室开展成为可能。真菌分类是人为界定的，l其目的在于使人们更为系统地认识真菌。真菌分类包括三个内容，l即真菌鉴定、i真菌分类和真菌系统发育，l代表了3种认识水平。真菌鉴定是针对单个真菌个体的比较和分类，l因此上述用于真菌分类的分子生物学技术大多可用于真菌的鉴定研究。

2.PCR早期的检测手段主要是DNA探针技术。文献报道可用于致病念珠菌鉴定的为DNA探针或为mtDNA片段，l或为rDNA片段，l甚至是某种特定的基因序列。自PCR技术诞生之后，l用DNA探针直接进行DNA-DNA杂交的做法便被淘汰。现在通常的作法是将DNA探针用作PCR反应中的靶DNA，l经过引物设计直接建立PCR诊断方法。

【检验诊断综台评价】

临床症状典型，l诊断并不困难。在不典型病例，l取阴道或男性龟头分泌物直接涂片、i革兰染色，l镜检见真菌孢子和菌丝，l结合分离培养有确诊意义。临床上应进行念珠菌培养，l由于不同的念珠菌药敏试验结果不同。因此，l念珠菌鉴定和药敏试验亦十分重要。分子生物学技术应用于念珠菌的分类鉴定和念珠菌病相关性研究。