在目前用于诊断呼吸道病毒感染的各种方法中，l抗原比抗体的检测更为敏感。

(一)直接免疫荧光法检测抗原

【实验原理】

用Chemicon呼吸道病毒诊断试剂，l对诱导痰或鼻咽分泌物中的纤毛柱状上皮细胞中的呼吸道病毒抗原进行染色，l确定特异性病毒抗原。本实验可同时检测流感A、i流感B、i腺病毒、i合胞病毒及副流感1、i2、i3型七种呼吸遭常见病毒抗原。

【操作程序】

(1)取患儿鼻咽分泌物1～2ml，l加入1PBS12～3ml，l用吸管反复吹打至分泌物完全混匀，l2000rpm离心10分钟，l弃去上清、i沉淀物再次做上述处理。

(2)用吸管吸取细胞悬液25μl，l点于事先备好的带孔玻片上，l每份标本点7孔，l室温干燥后用4℃丙酮固定10分钟。

(3)将25～40μl内含伊文思兰荧光标记的七种呼吸道病毒单克隆抗体，l分别滴加于标本上，l37℃温箱孵育30分钟，l用PBS／Tween洗片3次，l再用蒸馏水洗片，l干后用甘油缓冲液封片，l荧光显微镜下观察结果。

【结果判断】

呼吸道病毒抗原阳性细胞在荧光显微镜下，l细胞核和(或)细胞浆内可见苹果绿色荧光，l阴性细胞无荧光，l镜下呈红色。如一孔中细胞数大于200个，l且2％以上细胞显示细胞内染色为阳性，l即为该病毒感染。RSV与PIV为胞浆内染色，lIFV与ADV为核染色或浆内染色。

【方法学评价】

该方法敏感性强，l特异性高，l但其所需的荧光显微镜价格较为昂贵，l限制了它在基层医院中的推广。

(二)碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶桥联酶标法(APAAP)

【实验原理】第一抗体与特异性抗原结合，l第二抗体起桥联作用，l其中一个Fab段连接第一抗体，l另一个Fab段连接APAAP复合物，l通过APAAP复合物中的碱性磷酸酶催化底物显色，l以鉴定相应的抗原。本实验亦可同时检测流感A、i流感B、i腺病毒、i合胞病毒及副流感病毒1、i2、i3型七种呼吸道常见病毒抗原。

【实验操作】

(1)同‘直接免疫荧光法’步骤①；

(2)加5～10μl封闭液于标本上，l置37℃湿盒15分钟，l取出后用PBS冲洗3次，l风扇吹干；

(3)加5～10μl一抗于标本上，l置37℃湿盒115分钟，l取出后用PBS冲洗3次，l风扇吹干；

(4)加5～10μl二抗于标本上，l置37℃湿盒15分钟，l取出后用PBS冲洗3次，l风扇吹干；

(5)加5～10μl底物液于标本上，l置37℃湿盒7～10分钟，l取出后用PBS冲洗；

(6)5g／L甲基绿负染1～2s后用蒸馏水冲洗，l镜检。

【结果判断】

在普通光学显微镜下，l呼吸道病毒感染的患儿鼻咽分泌物中的纤毛柱状上皮细胞胞质和膜可特异地染成玫瑰红色，l核呈淡蓝色或无色(ADV核可呈红色，l或棱与胞质均为红色)。凡是找到3个以上典型的着色细胞即可判为阳性，l否则为阴性。

【方法学评价】

APAAP法不受待测标本组织或细胞的内源性过氧化物酶影响，l特异性较高，l不需特殊设备，l在普通光学显微镜下即可辨认，l操作简单、i快速，l易于在基层医院推广。