TORCH

TORCH抗体指弓形体(Toxplasma1gondii,lTG)、i风疹病毒(Rubella1virus,lRUV)、i巨细胞病毒(Cytomegalo1virus.CMV)、i单纯疱疹病毒(Herpes1simplex1virus,lHSV)一组由非细菌性微生物感染引起的血清特异性抗体。由TORCH引起的感染,l目前认为主要危害孕妇,l可导致流产、i死胎和畸胎及新生儿出生后出现的中枢神经系统功能障碍。

【病毒特征及临床表现】

巨细胞病毒是一类在自然界普遍存在的但又具有严格特异性的病毒,l届β疱疹病毒亚科,l致人类疾病的为人巨细胞病毒(HCMV)。人巨细胞病毒在人群中感染非常普遍,l但大多数呈临床不显性感染或潜伏感染,l多数人在少年或儿童期受人巨细胞病毒感染后获得免疫。HCMV广泛存在于孕妇的组织器官内,l可以随血流通过胎盘侵犯胎儿,l特别是在妊娠4个月内,l极易造成胎儿损害。胎儿早期被感染后,l引起宿主细胞的细胞免疫耐受,l以致允许病毒在细胞内缓慢增殖,l引起器官损伤,l轻者出现各种畸形,l严重者引起流产、i死胎。妊娠期母体原发感染时,lCMV多易致胎儿先天性感染,l如母体为复发感染,l因其体内有初次感染所产生的免疫力,l所以病毒量少,l不一定造成先天感染。后天获得性感染大多无症状,l但可间歇性或持续排毒。

单纯疱疹病毒是最早发现的人类疱疹病毒,l可分为两个血清型。l型主要感染唇、i面、i眼及非生殖器部位;2型主要感染肛周和生殖器周围。初次感染时太多无症状,l其中仅1%~10%有临床表现,l感染后该病毒潜伏于局部感觉神经节细胞中为带病毒者。当某些诱因,l如发热、i着凉、i消化不良使免疫力下降时,l此潜伏病毒沿神经移动至皮肤而引起疱疹。

风疹病毒是披膜病毒科风疹病毒属的惟一成员,l其自然宿主是人,l基因组为单链RNA。大多数情况下,l婴幼儿RUV的感染属于一过性和无明显临床症状的亚临床型感染,l而出现临床症状的患儿表现为出疹、i发热和淋巴结肿大等症状,l少数会发生较严重的并发症。孕妇妊娠的前4个月感染RUV,l病毒有可能经血液侵犯胎儿,l导致胎儿出现流产、i死产以及单个或多个器官的损伤,l产生先天性风疹综合征。

弓形体病是一种人畜共患传染病,l其病原体弓形体是一种球虫。许多国家感染率为20%~50%。人类弓形体感染较常见,l但临床表现明显的弓形体病却较少。可分为先天弓形体病和获得性弓形体病,l先天性弓形体病可为隐性感染,l也可呈多脏器受损的表现,l如:i发热、i皮疹、i鼓肠、i呕吐、i顽固性腹泻及黏液血便,l咳嗽、i气促、i发绀、i黄疸、i肝脾肿大、i脑膜脑炎、i脑积水、i精神或智力障碍等。中枢神经受损者预后很差,l妊娠早期严重感染可引起流产、i早产、i死胎。获得性弓形体病以内脏诸器官及全身症状为主,l轻重不等。严重者起病急骤,l有高热、i尉烈头痛、i全身肌肉疼痛,l嗜睡、i昏迷等全身毒血症及皮疹、i淋巴结肿大,l脑、i眼、i肝、i肾、i肺等器官受损等相应症状。轻型病例有发热但不高,l有淋巴结肿大等。

【病毒的实验室诊断】

1.病毒分离 传统的细胞培养是将标本接种于易感细胞后,l经过长期观察,l以确定有无典型的细胞病变出现。此法敏感性极高,l但敏感性受到许多因素的影响(包括感染病毒的数量、i接种细胞的种类及其状况、i培养条件、i标本的质量和孵育时间等),l技术条件要求高、i费时(出现细胞病变的时间至少要7~14天,l有时长达4周或4周以上),l达不到早期、i快速诊断的目的,l在一般的实验室很难开展。

2.病毒抗原检测(以CMV为倒)11当机体感染HCMV后,l可在外周血白细胞中检测到CMV抗原,l称为HCMV抗原血症,l晚期结构抗原pp65是活动性HCMV感染时,l外周血白细胞中出现的主要抗原。

【实验操作】

1.取2%EDTA-2Na11抗凝血2m1置于10ml玻璃管中。将0.7ml16%葡聚糖盐溶液置于上述10ml玻璃管中,l混匀,l于317℃沉降20分钟(试管呈45°放置)之后,l收集古有多形核白细胞的上清,l室温下11500rpm离心5分钟,l沉淀.以4℃的0.8%NH4CL12ml悬浮,l并于4℃孵育10分钟后,l加PBS15ml,l11500rpm离心5分钟,l弃上清,l再以同法洗2次,l沉淀以PBS悬浮,l白细胞计数,l使终浓度达到2×107/ml。

2.固定 取载玻片,l每孔以10μl白细胞涂片(即每孔白细胞数为2×105个),l涂片空气干燥至少30分钟,l之后置于冷丙酮固定10分钟,l空气干燥,l玻片保存于-20℃。阳性对照由HCMV1AD169株感染的人胚肺成纤维细胞涂片而成,l阴性对照由未感染的人胚肺成纤维细胞涂片而成。

3.免疫染色和镜检 抗HCMV晚期结构抗原pp65鼠单克隆抗体AAC10和荧光标记的兔抗鼠抗体FO261均以PBS111:120稀释。PBS湿片一次,l每孔加单抗10μl,l37℃孵育30分钟,lPBS洗片2次,l每次5分钟;加荧光抗体10μl,l37℃孵育30分钟,lPBS洗片2次,l每次5分钟。伊文思兰复染,l复染之后用PBS快速冲洗3次,l缓冲甘油封片,l荧光显微镜下观察。

【结果判定】

细胞核或核周呈现绿色荧光为阳性细胞,l阴性细胞呈红色。

【方法学评价】

HCMVpp65抗原血症的检测有助于HCMV激活感染的诊断、i疗效及预后监测,l目前已成为国际公认的标准方法之一。但由于该试剂盒尚未达到国产化,l进口试剂较为昂贵,l所以在我国没有广泛应用于临床。

3.PCR方法检测核酸(以CMV1DNA的检测为例)

【实验操作】

(1)标本处理:i取血清25μl.加25μl裂解液,l100℃水浴10分钟,l11500rpm,l离心10分钟,l取上清备用。

(2)扩增反应;取2.6μl110×buffer(内含500mmol/L1KCL、i100mmol/L1Tris-HCL、i151mmol/L1MgCL2和0.01%明胶),l加入dNTP,l使每种dNTP的终浓度为21mmol/L,l再加入引物,l使每种引物的终浓度为100pmol/L.加双蒸水至231μl,l组成PCR反应混合物,l加Taq酶1U,l加标本上清(或阴性对照、i阳性对照)21μl,l使反应总体积为261μl,l混匀后加2滴石蜡油,l离心数秒使两界面清晰,l置入PCR仪,l按下列条件扩增35个循环:i94℃30秒,l55℃130秒,l72℃30秒。

【结果判定】

取扩增后的PCR产物101μl加样于2%琼脂糖凝胶上,l电泳(由阴极至阳极2~4cm处),l紫外灯下观察,l有170bp的DNA条带者为HCMV血清DNA阳性。

【方法学评价】

利用PCR技术直接从病变组织中检测到病毒的DNA或RNA,l是快速、i敏感、i特异的诊断病毒感染的一种方法。该方法在用于监测免疫抑制患儿的HCMV感染时,l其敏感性高于病毒分离和抗原血症检测,l但特异性相对较低。

4.间接ELISA法检测IgM/IgG抗体

【实验操作】

同呼吸道病毒IgA抗体检测。

5.检测IgM/IgG抗体临床意义

(1)HCMV感染诊断标准

①原发感染:i抗HCMV1IgG抗体阴性,l伴其他任意一项检测阳性或抗HCMV1IgG抗体从阴性转为阳性。

②既往感染:i首次检测,l抗HCMV1IgG抗体即为阳性。

③潜伏感染:i血清PCR阳性,l伴或不伴HCMV1IgG抗体阳性,l其他检测阴性。

④活动性感染:i以下3项中至少1项存在:iA,l抗HCMV抗原血症阳性;B抗HCMV1IgM抗体阳性;C双份血清抗HCMVIgG抗体滴度呈≥4倍升高。

⑤无症状性感染:i仅有HCMV感染的实验室证据而无相应的症状。

⑥症状性感染:i除符合活动性感染的诊断标准外,l具备与HCMV感染相关的症状、i体征。

(2)抗原血症检测和血清PCR检测:i都是直接检测HCMV组成成分的实验室诊断方法,l而血清学检测则是为HCMV感染提供间接证据的实验室诊断方法。HCMV原发感染后,l抗HC-MV-IgM抗体和抗HCMV-IgG抗体相继出现,l一般在感染后的2~4周可检测到。免疫抑制患儿因为存在免疫异常,l在感染HCMV后可能不出现抗HCMV-IgM抗体反应。HCMV继发感染时,l可有抗HCMV-IgG抗体滴度的显著增高,l但抗HCMV-IgM抗体一般检测不到。抗HCMV-IgM抗体阳性常提示原发感染。血清特异性抗HCMV抗体多在病毒抗原血症后1~2周出现,l但有时始终不出现,l尤其见于严重的HCMV感染;随着抗HCMVIgG抗体的出现,l病毒抗原血症转为阴性。

(3)单纯疱疹病毒的血清学结果;对临床诊断意义不大,l因为HSV特异性IgM/IgG抗体出现较迟,l皮肤黏膜原发性疱疹中,l特异性抗体在发病后10~14天才出现,l在疱疹性脑炎患儿,l3~4周才出现抗体。自皮肤、i角膜、i生殖器等病变处取样,l分离到HSV乃是确诊的可靠方法。分离病毒DNA,l经限制性内切酶切割、i电泳凝胶分离,l可根据DNA酶切图谱的差异鉴别1型和2型HSV。

(4)先天性风疹感染婴儿血清中含有主动获得的RUV特异性IgM抗体和被动获得的母体IgG抗体,l来自母体的IgG抗体在生后3~6个月下降。因此,l在超过5~6个月龄婴儿血清中?检出RUV特异性IgG抗体,l且水平持续升高;以及在生后即检出RUV特异性IgM抗体,l在生后前6个月持续存在,l表明为先天性风疹病毒感染。

(5)有文献证实,l官内感染弓形体儿童出生时IgM滴度越高,l患重大疾病的机会越多。由于弓形虫感染后,l会破坏机体的免疫系统,l使免疫力降低,l免疫功能不全,l易导致感染弓形虫和其他疾病。