(一)高碘酸-无色品红(PAS)法
1.试剂配制
(1)0.5%高碘酸水溶液:i
高碘酸11110.5g
蒸馏水1111100ml
溶解后,l用小口砂塞瓶盛装,l置于4℃冰箱保存。使用前取出恢复至室温。
(2)0.5%偏重亚硫酸钠液:i
偏重亚硫酸钠110.5g
蒸馏水11111111100ml
溶解后,l用小口砂塞瓶盛装,l置于4℃冰箱保存。使用前取出恢复至室温。
(3)无色品红液(Schiff试剂):i
碱性品红1111111111111111g
蒸馏水11111111111111200ml
1N盐酸’1111111111111120ml
偏重亚硫酸钠111111~1.5g
活性炭111111111111~1.5g
取一只500ml的洁净三角烧瓶盛蒸馏水200ml并煮沸,l将碱性品红加入煮沸的蒸馏水中,l摇动数分钟使碱性品红完全溶解(此时溶液为深红色);待溶液冷却至50℃时,l过滤至另一只洁净三角烧瓶内,l加入1N盐酸20ml;待溶液冷却至25℃左右时,l再加入偏重亚硫酸钠,l随即用胶塞塞紧瓶口,l并轻轻摇动使其溶解,l此时碱性品红液的颜色明显变淡。将溶液置于室温、i暗处24h,l此时溶液应呈淡稻草黄色或淡红色。加入活性炭粉,l搅匀后,l塞瓶口轻摇1~2min,l静置1~2h;然后,l将溶液通过双层滤纸过滤到小口砂塞瓶内,l此时溶液应完全无色,l即为无色品红,l又称1Schiff液,l置于4℃冰箱内保存。
(4)亮绿水溶液:i
亮绿111111110.2g
蒸馏水111199.8ml
冰醋酸111110.2ml
2.染色程序
(1)组织块固定于4%中性甲醛液中,l常规脱水、i石蜡包埋和切片。
(2)切片脱蜡至水。
(3)0.5%高碘酸氧化5~8min。
(4)流水冲洗2min,l再用蒸馏水洗。
(5)入无色品红液,l于暗处并加盖作用10~20min。
(6)0.5%偏重亚硫酸钠液滴洗2次,l每次约lmin。
(7)流水冲洗5min。
(8)亮绿水溶液复染数秒。
(9)稍水洗。
(10)常规脱水、i透明,l中性树胶封固。
3.染色结果111真菌呈品红色,l组织呈绿色。
(二)六胺银法
1.试剂配制
(1)8%铬酸水溶液:i
铬酸111111111111111118g
蒸馏水1111111111111l00ml
(2)0.5%偏重亚硫酸钠液
偏重亚硫酸钠1111111110.5g
蒸馏水11111111111111100ml
(3)5%硝酸银溶液:i
硝酸银111111111111250mg
蒸馏水111111111111115ml
(4)3%六次甲基四胺水溶液
六次甲基四胺11111111113g
蒸馏水11111111111111100ml
(5)5%四硼酸钠液:i
四硼酸钠11111111111115g
蒸馏水1111111111111100ml
(6)六胺银贮备液:i
5%硝酸银水溶液111111111115ml
3%六次甲基四胺水溶液1111l00ml
将3%六次甲基四胺水溶液加入5%硝酸银溶液中,l随即形成白色沉淀;此沉淀在摇动中立即溶解。取澄清液置于℃冰箱内保存,l可在数月内使用。
(7)六胺银工作液:i
六胺银贮备液1111111111l0ml
蒸馏水111111111111111125ml
5%四硼酸钠液11111111112ml
将5%四硼酸钠液加入蒸馏水中,l然后加入六胺银贮备液,l搅拌混合后即可使用。
(8)1%氯化金水溶液:i
氯化金1111111g
蒸馏水111l00ml
先配制上述1%氯化金液贮存,l另用蒸馏水与原液按9:i1稀释成0.1%氯化金液。
(9)2%硫代硫酸钠液
硫代硫酸钠1111111111112g
蒸馏水11111111111111100ml
(10)亮绿水溶液:i
亮绿111111111111111110.2g
蒸馏水11111111111111100ml
冰醋酸1111111111111110.2ml
(11)橙黄G染液:i
橙黄G111111111111111112g
蒸馏水11111111111111100ml
磷钨酸111111111111111115g
2.染色程序
(1)组织块固定于4%中性甲醛液中,l常规脱水、i石蜡包埋和切片。
(2)切片脱蜡至水。
(3)8%铬酸水溶液氧化20min。
(4)自来水稍洗。
(5)5%偏重亚硫酸钠液处理lmin。
(6)流水冲洗5min,l再用蒸馏水洗2次。
(7)置入六胺银工作液于温箱内(58~60℃)60~90min,l至切片呈黄褐色,l即在显微镜下观察,l见真菌呈黑褐色为止。
(8)蒸馏水洗。
(9)滴入0.1%氯化金溶液调色2~3min。
(10)流水稍洗。
(11)2%硫代硫酸钠液处理2~5min。
(12)流水冲洗5min。
(13)用亮绿液复染20~40s,l或用橙黄G复染l~2s。
(14)快速水洗。
(15)95%乙醇和无水乙醇脱水。
(16)二甲苯透明,l中性树胶封固。
3.染色结果111各种真菌均被着色。菌丝和孢子呈明显的黑褐色,l抗酸杆菌也呈黑褐色。背景为淡绿色(用亮绿复染时)或橙黄色(用橙黄G复染时)或红色(用伊红复染时)。
(三)爱先蓝(alcian1blue)法
1.试剂配制
(1)爱先蓝水溶液(pH2.5):i
爱先蓝111111111g
蒸馏水11111197ml
冰醋酸11111113ml
麝香草酚111150mg
(2)核固红液:i参见本节的“二、i”项“(一)氢氧化银氨液浸染法(I)”。
2.染色程序
(1)组织固定于4%中性甲醛液中,l常规脱水、i石蜡包埋和切片。
(2)切片脱蜡至水。
(3)爱先蓝染液染10~20min。
(4)稍水洗。
(5)核固红液复染5~10min。
(6)稍水洗。
(7)常规脱水、i透明,l中性树胶封固。
3.染色结果111新型隐球菌的荚膜呈蓝色,l胞核呈红色。