(一)组织切片和细胞涂片的制备
参见第3章第一、i二节。
(二)抗体的选择、i稀释和保存
1.选择抗体应先了解其反应谱和适用条件[包括适用切片(石蜡切片抑或冷冻切片)、i稀释度和温育时间等]。
2.对于未曾使用过的新抗体，l应按照有关说明书的提示，l以几个不同的稀释度对适宜检材(已知阳性切片／涂片)进行预试验；根据染色阳性表达的程度和检材背景着色程度，l确定用于染色的最适稀释度。
3.抗体的原液应于分装后置于－20℃冷室中保存，l切勿反复冻存(以免效价降低)。
4.抗体的工作液可置于4℃冰箱中保存。
5.抗体的稀释。
(1)一般用0.01M1PBS(生理盐水磷酸盐缓冲液)，lpH值7.2。
(2)或用0.05M1TBS(生理盐水三羟基氨基甲烷缓冲液)，lpH值7.6。
(3)必要时可按需要加适量小牛血清清蛋白。
(三)被检测组织内抗原的修复
1.经41％中性甲醛之类含醛基固定剂固定的组织，l其切片中的抗原决定簇因醛的交联作用而被封闭，l从而影响抗原一抗体反应。进行免疫组织化学染色前，l对于组织切片进行抗原修复处理，l会使组织中的固有抗原尽量多地暴露出来，l提升了大部分检测抗体的阳性率和反应强度。有的抗体不需要进行抗原修复。应按抗体试剂说明书的提示决定是否进行被检测组织内的抗原修复。
2.抗原修复缓冲液。
(1)一般为0.01M柠檬酸缓冲液(2.19柠檬酸溶于100ml蒸馏水中，l用2M1NaOH调节pH值至6.0)。
(2)有些抗体需要特殊修复缓冲液，l如高pH值的EDTA(50mm1Tris，l10mM1EDTA，lpH9.o)，l或商品化的该高pH修复液等。
3.抗原修复的常用方法。
(1)胰蛋白酶消化法：i
①组织切片脱蜡、i水化。
②滴加一滴0.1％胰蛋白酶液于组织切片上。
③37℃下温育20～40min(温育时间取决于组织经4％中性甲醛固定时间的短和被检测抗原)。
④蒸馏水冲洗，l终止反应。
⑤阻断内源性过氧化物酶。
⑥进行免疫组织化学染色。[配制0.1％胰蛋白酶液时，l应将0.19胰蛋白酶溶于0.1％无水氯化钙水溶液(pH值7.8)中。]
(2)胃蛋白酶消化法：i
①组织切片脱蜡、i水化。
②滴加胃蛋白酶工作液于组织切片上。
③37℃下温育10～30min(--般为lemin，l可延至30min，l取决于组织经4％中性甲醛固定时间的长短)。
④浸入蒸馏水，l终止反应。
⑤进行免疫组织化学染色。用0.1％胰蛋白酶液37℃下处理20min。(应以0.1M1HCI配制胃蛋白酶工作液。过度的胃蛋白酶消化会使组织结构破坏、i切片脱落。)
(3)微波修复抗原法：i
①组织切片脱蜡、i水化(硅化玻片或经防脱片胶处理的玻片)。
②将组织切片置于容器(塑料盒或玻璃缸)中，l并向其中加入抗原修复液200ml，l盖上具有小孔的盖子。
③将该容器置于微波炉(705～800W)中央加热(95℃)5min，l2次(于两次之间，l应向容器中添加蒸馏水50ml，l严防组织切片干燥)。
④将该容器移出微波炉，l置于室温下冷却15～20min。
⑤蒸馏水冲洗。
⑥阻断内源性过氧化物酶，l而后将切片置于蒸馏水中。
⑦用TBS或PBS液冲洗。
⑧进行免疫组织化学染色。
(4)热水浴法：i
①组织切片脱蜡、i水化(硅化玻片或经防脱片胶处理的玻片)。
②向装组织切片的容器加入足量(例如200m1)抗原缓冲液，l置于水浴锅中，l加热至95～99℃(不沸腾)预热。
③将组织切片插入已预热的容器内，l温育20～40min。
④将该容器由微波炉移出，l置于室温下冷却20min。
⑤室温下，l用TBS、iPBS或水洗。
⑥蒸馏水冲洗。
⑦阻断内源性过氧化物酶，l而后将切片置于蒸馏水中。
⑧用TBS或PBS液冲洗。
⑨进行免疫组织化学染色。
(5)压力锅法：i
①组织切片脱蜡、i水化(硅化玻片或经防脱片胶处理的玻片)。
②向4～5.5L的不锈钢压力锅中加入抗原修复缓冲液(约为锅容积的2／3)，l不加阀情况下加热至沸腾。
③将组织切片插放于金属切片架上，l并置于压力锅内沸腾的缓冲液中。
④加阀情况下，l将组织切片加压2min。
⑤压力锅自行冷却或以流水冷却减压后，l持续20min。
⑥将冷却后的切片取出，l蒸馏水冲洗后，l置于TBS或PBS液中(以免组织切片干燥)。
⑦蒸馏水冲洗。
⑧阻断内源性过氧化物酶，l而后将切片置于蒸馏水中。
⑨用TBS或PBS液冲洗。
⑩进行免疫组织化学染色。
(四)组织切片中内源性酶的阻断
1.内源性过氧化物酶主要存在于红细胞、i嗜中性粒细胞、i单核细胞、i嗜酸性粒细胞和组织内。阻断方法：i最常用0.3％～０.5％H2O2-甲醇液，l作用15～30min，l阻断液必须使用时新鲜配制。由于阻断内源性过氧化物酶常同时导致被测抗原变性(使特异性着色减弱)，l而大部分组织不含有内源性过氧化物酶，l所以阻断内源性过氧化物酶一般不必作为常规步骤。必须阻断内源性过氧化物酶时，l可安排在第一抗体反应后进行，l以减少抗原的破坏。
2.内源性碱性磷酸酶主要存在于嗜中性粒细胞和内皮细胞。阻断方法：i应用1M左旋咪唑，l作用15～30min。
3.内源性生物素11肝、i胰、i肾等的细胞内含有多量生物素或类生物素物质。阻断方法：i先将切片浸于卵白素(０.5μg／m1)中15min，l以缓冲液洗净后，l移浸于生物素饱和溶液中15min，l再用缓冲液洗去多余的生物素饱和液；也可应用商供的阻断试剂盒(按说明书操作)。
(五)正常血清保护
作为检测试剂的抗体蛋白带有一定的负电荷，l免疫组织化学染色时，l易与带有正电荷的组织[特别是纤维组织、i变性和(或)坏死的细胞、i嗜酸性粒细胞等]发生静电吸引而导致非特异性染色。去除这种非特异性染色最有效的方法是，l在滴加第一抗体前，l先滴加用于制备第二抗体动物的非免疫血清或是滴加除制备第一抗体动物以外的其他动物非免疫血清，l浓度为1：i5～1：i20；必要时可滴加2％～5％牛血清清蛋白。正常血清保护作用时间10～20min。用于阻断非特异性结合的血清不能有明显的溶血。
(六)缓冲液
用于稀释抗体，l洗涤切片的缓冲液主要有两种。
1.BS(0.05M，lpH7.6)
Tris-HCI缓冲液(0.5M，lpH17.6)*1111100ml
8.5％NaCl1111111111111111111111111100ml
蒸馏水加至11111111111111111111111111000ml
Tris—HCI缓冲液(0.5M，lpH17.6)
三羟甲基氨基甲烷(Tris)1111111111111111161g
HCl111111111111111111111111111111111137ml
蒸馏水加至111111111111111111111111111000ml
2.PBS(0.1M，lpH17.6)
Na2HP04?12H201111111111111111111111111129g
NaH2P04?2H2011111111111111111111111111113g
NaCl1111111111111111111111111111111111185g
蒸馏水加至1111111111111111111111111111000ml
使用时用蒸馏水稀释10倍即成0.01M。