(一)直接法

1.脱蜡和水化。

2.3％过氧化氢或0.5％过氧化氢甲醇液，l5min。

3.TBS或PBS缓冲液洗涤。

4.抗原修复。

5.无关动物正常血清(适当稀释)20～30min。

6.甩去正常动物血清，l滴加适当稀释的辣根过氧化物酶标记抗体，l或增强的酶标多聚物一步法(Enhanced1Polymer1One-step1Staining，lEPOS)抗体于切片上，l20～60min。

7.TBS或PBS缓冲液洗涤。

8.0.04％～o.05％DAB(二氨基联苯胺四盐酸)-H2O2液显色5～10min，l镜下观察控制显色时间。底物配法：iDAB140～50mg，l0.05M1TBS(pH17.6)100ml，l3％1H202100～200ml。

9.缓冲液洗，l流水洗涤。

10.苏木精淡染细胞核。

11.脱水，l透明，l封片。

(二)间接法

1～5步同“直接法”。

6.滴加第一抗体于切片上，l湿盒内温育30～60min。

7.TBS或PBS缓冲液洗涤。

8.HRP标记抗体或用增强的酶标记多聚物(Enhanced1Labeled-Polymer1System，lELPS)抗体滴加切片上，l湿盒内温育30min。

9～14步同“直接法”的7～11步。

(三)过氧化物酶-抗过氧化物酶(PAP)法

1～5步同直接法。

6.适当稀释的第一抗体，l湿盒内温育30～60min。

7.缓冲液洗涤。

8.第二抗体，l湿盒内温育30min。

9.缓冲液洗涤。

10.滴加PAP，l湿盒内温育30min。

11～15步同“直接法”的7～11步。

双PAP法：i上述操作进行到第10步后，l再重复7～10步1次，l然后继续11～15步。

(四)葡萄球菌A蛋白(SPA)免疫酶法

1～5步同“直接法”。

6.第一抗体，l湿盒温育30～60min。

7.缓冲液洗涤。

8.酶联SPA，l湿盒温育30min。

9.缓冲液洗涤。

10～13步同“直接法”的8～11步。

(五)ABe法和SABC法

ABC法是卵白素一生物素一酶复合物(Avidin—Biotin—Peroxidase1Complex)法的简称。SABC法是链霉卵白素一生物素一酶复合物(Streptavidin—Biotin—Peroxidase1Complex)法的简称。

1～5步同“直接法”。

6.第一抗体，l湿盒温育30～60min。

7.缓冲液洗涤。

8.生物素化的第二抗体，l30min。

9.缓冲液洗涤。

10.ABC复合物或SABC复合物(皆于使用前新鲜配制)，l30～60min。

11～15步同“直接法”7～11步。

(六)LSAB(SP)法

LSAB(SP)法，l是标记的链酶卵白素-生物素(Labeled1Streptavidin-Biotin)法的简称，l操作步骤同“ABC法”，l只是以LSAB复合物替代ABC复合物。

(七)CSA法

CSA法是催化信号放大(Catalyzed1Signal1Amplification)法的简称。

1～5步同“直接法”。

6.第一抗体，l15～30min。

7.缓冲液洗涤。

8.生物素标记的第二抗体，l15～30min。

9.缓冲液洗涤。

lO.链霉卵白素-生物素-HRP复合物(用前新鲜配制)，l15min。

11.缓冲液洗涤。

12.放大液，l15min。

13.缓冲液洗涤。

14.HRP-Streptavidin，l15min。

15～19步同“直接法”的7～11步。

(八)二步法Envision1System

Envision是通过一个多聚葡聚糖骨架联接成一个多聚体。

1～5步同“直接法”。

6.第一抗体，l30～60min。

7.缓冲液洗涤。

8.Envision1TM，l10～30min。

9～13步同“直接法”的7～11步。

(九)双重免疫组织化学法

1.Sequential

(1)鼠或兔抗体1，l30～60min。

(2)Envision1TM，l羊抗鼠／羊抗兔／HRP，l301min。

(3)DAB(棕色)，l2～101min。

(4)鼠或兔抗体2，l30～601min。

(5)Envision1TM，l羊抗鼠／羊抗兔／AP，l301min。

(6)AP(红色)。

2.Simnl-Aaneous

(1)混合鼠抗体1和兔抗体2，l4℃，l过夜或601min。

(2)Envision1TM羊抗鼠／HRP和羊抗兔／AP。

(3)AP染色。

(4)HRP染色。

上述方法除注明温度者外，l均可在室温(20～25℃)环境中进行；第一抗体温育后，l如有必要可置于4℃下过夜。