(一)组织样本超薄切片的制备

1.固定11在0～4℃下，l将约为lmm3的待检组织块(样本)固定于2％～4％戊二醛磷酸钠缓冲液(pH7.2～7.3，l分子渗透压在380mmol左右)中，l浸泡30～90min；也可通过血管灌注，l将1％～2％戊二醛灌注到需要固定的组织、i器官内。

2.漂洗在4℃下，l将经过戊二醛固定的组织块用0.1mol／L磷酸缓冲液漂洗1h或过夜，l其间换液3次。

3.四氧化锇后固定1111在0～4℃下，l将组织块置于四氧化锇磷酸缓冲固定液中浸泡60～120min。

4.脱水1111组织块依序经30％(或50％)、i70％、i90％丙酮各lOmin，l最后进入纯丙酮(更换3次，l共10min)，l总计40min。

5.浸透1111组织块依序浸入①纯丙酮：i树脂包埋剂(1：i1)，l室温下1h；②纯丙酮。树脂包埋剂(1：i2)，l室温下2h；③纯树脂包埋剂，l室温下3h以上或过夜。

6.聚合1111将充分浸透的组织块，l置入装满包埋剂的胶囊中，l在37℃烤箱内聚合12h，l然后在60℃烤箱内聚合24h。常用的树脂包埋剂有环氧树脂618、i812、i1Spurr、iK4M树脂等。使用环氧树脂812(Epon1812)时，l应避免潮气。保持干燥是聚合过程中的关键，l否则有可能聚合不均匀、i硬度和弹性不当等，l影响超薄切片。

7.切片11用超薄切片机先做半薄切片(1um)或薄切片(3um左右)，l进行光镜检查定位，l然后再做超薄切片(40～50um)。

8.捞片和染色11用镊子夹取一个铜网，l将满意的切片捞在铜网的中央；再先后用2％醋酸铀和6％柠檬酸铅染色各30min。

(二)血液样本超薄切片的制备

依序为：i①经1％肝素或5％EDTA抗凝的静脉血2～4ml；②11000～11500r／1min离心l0mim③尽量吸除离心后的上清液，l沿管壁缓慢加入2％～4％戊二醛1～2ml，l进行固定；④固定2～4h时，l使浅黄色层凝结成块；⑤取浅黄色层凝块，l切成1mm3细条，l然后置入缓冲液漂洗；⑥按组织样本超薄切片的制备方法进行后固定、i脱水和包埋(注意：i应将检材细条平放包埋)。

(三)骨髓样本超薄切片的制备

依序为：i①经1％肝素或5％EDTA抗凝的骨髓穿刺物0.5～lml；②离心(11000～11500r／min)后取髓粒，l或直接细心地挑取髓粒；③2％～4％戊二醛磷酸钠缓冲固定液固定2～4h；④按上述组织样本超薄切片的制备方法进行后固定、i脱水和包埋。

(四)游离细胞样本超薄切片的制备

1.悬浮于液体中的游离细胞经离心(11000～11500r／min)沉淀或其他方法使之聚集，l去除无关成分后，l用0.1mol／L二甲砷酸钠缓冲液或0.1mol／L磷酸钠缓冲液漂洗。

2.41℃下，l用1.25％戊二醛／二甲砷酸钠缓冲液或0.1mol／L磷酸钠缓冲液悬浮固定30～60min。

3.离心(11000r／min)5min，l去上清液。

4.再用0.1mol／L二甲砷酸钠缓冲液或0.1mol／L磷酸钠缓冲液漂洗标本，l15min。

5.重复“步骤3”和“步骤4”，l共漂洗3次，l离心(11000r／min)后尽量吸取上清液。

6.加1～2滴新鲜血浆并用细针搅拌均匀，l也可用2％琼脂或7％明胶代替血浆。

7.缓慢加入2％戊二醛，l静置2h，l使细胞凝聚成团块。然后取出并切成lmm3小块放入缓冲液漂洗。

8.按组织样本超薄切片的制备方法进行后固定、i脱水和包埋。

(五)负染色技术

1.用毛细吸管将液体样本滴到具有支持膜的载物铜网上，l根据样本的浓度可立即染色，l或放置数分钟以至更长时间后染色。

2.用滤纸吸去铜网上滴液边缘的余液，l遂即滴加磷钨酸染液(pH6.4～7.0)，l持续数秒至l～5min，l然后用滤纸吸干染液。