(一)新鲜实体瘤单细胞悬液的制备

1.酶消化法

(1)选取的组织立即放入预冷的组织培养液或生理盐水中，l清洗血迹及其他污染物。

(2)解剖显微镜下弃除组织块中的坏死成分、i纤维、i脂肪以及血管等。

(3)用弯剪将组织块剪成约1.0mm3左右的小块，l放在冷组织培养液或生理盐水中。

(4)用冷培养液或生理盐水漂洗剪碎的组织块，l洗去被剪碎的细胞碎片。

(5)取约1.0g组织加入适宜的酶消化液。

(6)在37℃的恒温水浴中消化20～30min，l消化期间要间断振荡或吹打。

(7)用冷培养液或生理盐水终止消化，l收集单细胞悬液。

(8)先后用200目的筛网和350目的尼龙网过滤除去凝聚的细胞团块，l收集细胞并计数，l总量不少于106个。根据检测目的作进一步测试。如做DNA含量分析，l须将细胞悬液用70％冰冷乙醇固定，l置4℃冰箱保存；如做免疫荧光分析，l则不必用乙醇固定。

2.机械法

(1)剪碎法

①将组织块放入平皿中，l加入少量生理盐水或0.01mol／L(pH7.4)的PBS液；

②用剪刀将组织剪至匀浆状；

③加入0.011mol／L1PBS1l0ml；

④用吸管吸取组织匀浆，l先以200目的筛网过滤至试管内；

⑤离心沉淀(11500r／min，l3～5min)，l再用PBS洗3次，l每次离心(500～800r／1min)5～8min，l除去细胞碎片；

⑥以350目的尼龙网过滤，l除去凝聚的细胞团块。

(2)网搓法。

①将100目的尼龙网扎在小烧杯上(为减少污染，l可将小烧杯固定在试管架上)；

②将剪碎的组织放在网上，l以眼科镊子或刮刀轻搓组织块，l边搓边以盐水冲洗，l直至将组织搓完；

③收集细胞悬液：i500～800r／min离心沉淀5～8min，l然后倾弃细胞碎片，l做细胞计数(应不少于108个)。

(3)研磨法

①先将组织剪碎至小块；

②将组织块放入组织研磨器中，l加入1～2ml生理盐水；

③转动研棒，l制备匀浆；

④加人生理盐水10～20ml，l冲洗研磨器，l收集细胞悬液，l并经350目尼龙网过滤，l离心(500～800r／min)沉淀5～8min。

3.化学法(EDTA螯合法)

(1)将组织切成小块放入试管中。

(2)先加入EDTA液5ml，l室温下30min，l然后弃去EDTA液。

(3)再加入EDTA胰酶5～10ml，l在37℃恒温水浴中作用30min，l其间间断振荡3～5次。

(4)用350目尼龙网过滤，l离心沉淀(11000r／min)5min；再以生理盐水洗2～3次，l离心(800r／min)5～8min。

(5)收集细胞悬液再离心1次，l然后弃去上清液，l将管底的细胞吹打均匀后吸入细颈吸管内，l总体积约0.1～0.2ml；将其用力吹人70％的预冷乙醇中并不断振荡，l避免细胞结成团块。在样本固定后置4℃冰箱中待检。

上述的酶消化法、i机械法和化学法可单一选用或联用。

4.低渗液处理法

(1)选取新鲜肿瘤组织0.59，l剪成1.0mm左右的组织块，l置于10ml试管中。

(2)加入Tris缓冲液5ml，l离心洗涤1次。

(3)加入染液一去污剂溶液5～10ml，l置于4℃冰箱中12～24h。

(4)用350目的尼龙网过滤去除细胞团块及组织块，l离心(11500r／min)沉淀5～8min，l获得细胞核悬液。

(5)用标准染液进行DNA染色，l上机检测。

(6)如保存样本，l须将其固定于70％乙醇，l然后置于4℃冰箱中备检。

(二)新鲜实体瘤单细胞脱核悬液的制备

适用于细胞核内成分的分析，l特别是用于DNA定量和细胞周期测定。

1.快速核分离和染色程序的一步法

(1)配制细胞核分离一染色液：i

Ca2＋(1mmol1CaCl2)

Mg2＋(0.51mmol1MgS04)

NP-40(0.6％)

BSA(2％)

磷酸等渗盐缓冲液PBS(0.011mmol，lpH7.2)11000ml

(2)荧光染料的配制：i

①碘化丙啶(propidium1iodide，lPI)溶液：i碘化丙啶5mg，lRNA酶2mg，lTriton1X-l00111.0％(或NP-40110.5m1)，l生理盐水65ml，l枸橼酸钠100mg，l加蒸馏水至100ml，l调pH为7.2～7.6，l置于4℃冰箱避光保存备用。

②溴化乙啶(ethidium1bromide，lEB)溶液：i配制方法同PI，l但浓度为PI用量的1／5，l即每100ml染色液中仅含lmg的EB。

(3)核分离和染色程序：i

①按前述新鲜实体瘤单细胞悬液的制备方法获得样本。

②放入分离液染色液3～5ml，l室温下保持3min。

③用200目的尼龙网过滤，l除去组织碎片，l20％冷乙醇固定。

④将细胞悬液固定液离心后弃去，lPBS缓冲液洗l或2次。

⑤加入PI染液1.5ml，l进行DNA染色(至少30min)，l上机待检。样品也可保存在4℃冰箱中。

2.核分离和染色程序的多步法

(1)细胞核分离一染色液的配制

①枸橼酸冲洗液：i将85.59蔗糖(250mmol／L)和11.769枸橼酸三钠-2HzOz(40retool／L)溶于约800ml蒸馏水中，l再加入50ml二甲基亚砜(DMSO)，l加入蒸馏水至总体积11000ml(pH7.6)。

②贮液：i贮液用于制备A液、iB液、iC液和流式细胞仪鞘液。将29柠檬酸三钠?2心Q(3.4mmol／L)、i2mlNP40(0.1％V／V)、i1041mg四氯酸精胺(1.5mmol／L)、i121mg羟甲基甲胺(Tris)(15mmol／L)加入蒸馏水，l使总体积为21000ml，l调整pH至7.6。

A液：i将15g胰酶溶于500ml贮液中(pH7.6)。

B液：i将250mg胰酶抑制剂和5009RNA酶溶于500ml贮液中(pH7.6)。

C液：i将208gPI和500mg四氯酸精胺加至500ml贮液中(pH7.6)，l避光保存。

③染液的长期贮存方法：i将5ml染液分装在塑料管中，l－80℃下贮存。使用前，l将贮存的染液立即置入37℃的水浴中，l然后将A液和B液在室温下保存，lC液保持在冰浴中。

④细胞长期贮存方法：i将柠檬酸缓冲液分装在冻存管中(400μl／管，l每管可悬浮大约106个细胞)，l置于液氮中存放；或将冻存管置于干冰和99％乙醇中，l存贮于－80℃冰箱中。检测前，l先将样品迅速置于37℃水浴中复苏和染色。

(2)核分离和染色程序

①将1.8ml的A液加入0.2ml柠檬酸缓冲液的细胞悬液中，l将试管缓慢倒置、i混匀。

②室温下，l10min内将管轻轻上下倒置5或6次。

③加入1.5ml1B液，l10min内轻轻倒置几次。

④加入1.5ml1C液(原在冰浴中)，l轻轻将管倒置。

⑤通过350目的尼龙网过滤样本，l加入C液染色后上机分析。

(三)石蜡包埋组织单细胞悬液的制备

1.制备40～50um厚的石蜡包埋组织切片若干张，l切片不可过薄或过厚，l过薄碎片多，l过厚则脱蜡不易干净。

2.将切取的组织片放入试管中。

3.加入3～5ml二甲苯进行脱蜡，l一般需要1或2d，l根据石蜡脱净与否可换1次二甲苯；待石蜡脱净后，l弃去二甲苯。石蜡脱净时，l无絮状物浮起。

4.依次加入100％、i95％、i70％和50％的梯度乙醇各5ml进行水化，l每步水化10min，l最后加入蒸馏水3～5ml，l3～5min后弃之。

5.加入5ml胃酶消化液(0.5％)，l置于37℃恒温水浴中消化30min。消化期间每隔5～10min振荡1次。消化时间不可过长，l以免造成已释放出的细胞核被消化。

6.消化30min后，l立即加入生理盐水以终止消化。

7.经300目的尼龙网过滤。为使组织片完全消化，l也可进行二次消化。

8.收集细胞悬液，l离心(11500r／min)沉淀后再以生理盐水漂洗1或2次，l低速离心(500～800r／min)沉淀，l以去除细胞碎片。

9.用制备好的细胞悬液作涂片，lAO染色；在荧光显微镜下观察，l应为完整细胞核，l细胞核呈现黄绿色荧光。

10.单细胞悬液样品以预冷的70％乙醇固定待检。

11.使用PI或EB染色，l必须先用新配制的0.1％的RNA酶(PBS中)在37℃下处理1h，l离心后再将沉淀悬浮于10μg／ml1PI或EB中染色，l在4℃暗处待测。

(四)血液单细胞悬液的制备和检测项目

1.应用淋巴细胞分离液分离血中的单个核细胞(淋巴细胞、i单核细胞、i白血病细胞和网织红细胞等)。一般将100U肝素加入lml全血中，l进行抗凝。淋巴细胞分离液有商品供应。

2.进一步分离和纯化淋巴细胞或单核细胞的方法。

(1)贴壁法：i将分离出来的细胞置人玻璃平皿中，l于37℃的温箱中静置2h，l待单核细胞贴附于玻璃平皿后，l吸出未贴附的游离细胞即为较纯的淋巴细胞。

(2)抗体和(或)补体工作液：i用相应的单克隆抗体结合细胞表面抗原，l在补体存在的情况下，l杀伤表达相应特异性抗原的细胞。

(3)磁力离心法：i将吸附相应单克隆抗体的微球与血细胞混合，l然后用磁力离心机将需要的细胞分离出来。由于微球的直径仅有数微米，l所以不会影响所分离细胞的生物学特性。

3.检测项目。

(1)应用标记了荧光素的相应单克隆抗体可以定性或定量检测细胞膜抗原，l例如检测血细胞的免疫表型。这是进行免疫学诊断和临床治疗的一项重要指标。

(2)检测白血病细胞的DNA和进行细胞周期分析，l可作为评估化疗疗效、i预后和是否复发的重要参考指标。

(3)应用DNA与荧光素化学结合的染色反应来推算细胞的倍体和细胞周期。

(五)细胞培养液中单细胞悬液的制备

1.悬液中获取的细胞数量必须足够多，l形态必须完整。

2.对于贴壁生长细胞，l适当应用酶消化法(0.29％胰酶)是获取完整细胞的关键。在显微镜下观察到细胞间出现裂隙时应终止消化，l然后用吸管吹打分散成单细胞，l收入离心管中。

3.有必要适当配合应用0.04％EDTA来解除细胞间的联结。

4.低速(800～11000r／min)离心5min；弃上清液，l加冷PBS(pH7.4)，l均匀吹打，l再次用PBS(pH7.4)均匀吹打，l低速(800～11000r／min)离心3次，l3～5min／次，l以去除悬液中的细胞碎片。

5.将细胞沉淀轻轻吹打均匀，l加0.5ml1PBS，l根据实验目的选择染液，l在4℃冰箱染色，l然后上机检测。

6.每份样本中的细胞数一般不应少于106个。

7.尽量减少细胞洗涤过程。用荧光素直接标记的单抗可减少洗涤次数。进行DNA染色时，l细胞分散均匀时也无须多次洗涤。

8.以悬浮法培养的细胞或细胞悬浮生长，l则不须消化。

9.用贴壁细胞或悬浮细胞制作的FCM样品中，l死细胞均不宜超过5％，l以免影响测试结果。

(六)胸水、i腹水、i细针穿刺物等单细胞悬液的制备

参见上文“(五)细胞培养液中单细胞悬液的制备”。