(一)亚“G1”峰检测法

原理：i处于增殖周期中的细胞，l根据其所处不同周期时相(G0／G1、iS、iG2／M)，l其DNA含量分布在2～4n之间。发生凋亡的细胞由于核内DNA裂解成许多小片段，l在乙醇固定后用细胞膜通透剂使小分子量的DNA片段穿过细胞膜而丢失，l仅剩下大片段DNA，l这些失去部分DNA含量的细胞，l在DNA染色后，l形成一个1DNA含量＜2n(即＜G1期细胞)的分布区，l称为“亚G1峰”。

1.样品来源

(1)悬浮生长的培养细胞；

(2)贴壁生长的培养细胞经胰酶蛋白酶消化后的细胞悬液；

(3)离体细胞悬液。

2.样品分组

(1)空白对照组(未经诱导凋亡处理组)；

(2)实验组(经诱导凋亡处理组)。

3.材料和试剂

(1)PBS缓冲液；

(2)70％乙醇；

(3)DNA抽提缓冲液：i取192ml10.2mol／L1Na21HPO4，l与8ml10.1mol／L枸橼酸混合，l调整pH至7.8；

(4)DNA染液：i取200μgPI溶于10ml1PBS，l加入2mg元DNA酶活性的RNA酶。

4.操作步骤

(1)(1～5)×106个细胞，l用70％乙醇固定(0～4℃冰箱)，l2h以上。

(2)洗涤离心，l弃乙醇，l细胞重新悬浮于10ml1PBS中，l再离心，l弃上清液。

(3)DNA片段抽提：i将细胞重新悬浮于0.5ml1PBS中，l加入lml1DNA抽提缓冲液，l混匀，l室温下静置5min，l离心，l弃上清液。

(4)DNA染色：i将细胞重新悬浮于lml1DNA染液，l室温下避光染色30min。

(5)流式细胞仪测定：i选用波长488nm激发光，l同时测定红色荧光和前向角散射光；每例样品测定5000～101000个细胞。

所有离心步骤均为11000r／min，l5min。

(二)末端转移酶标记技术

1.原理1111经末端转移酶标记后的细胞(带有绿色荧光-FITC)，l再经DNA荧光染色(红色荧光一PI)后，l这种带有双重荧光信号的细胞经流式细胞分析检测，l可显示出不同周期时相的细胞凋亡情况。

2.样品来源1111由培养细胞或离体细胞制成的单个细胞悬液。

3.材料和试剂1111同原位末端转移酶荧光标记技术。

4.操作步骤

(1)固定：i收集(1～5)×106个细胞于离心管内，l离心，l弃上清液，l重新悬浮于5ml1PBS中；再离心，l弃上清液。用1％多聚甲醛悬浮细胞，l4℃冰箱内固定15min后，l离心，l弃固定液，l用80％乙醇再固定2h(0～4℃冰箱内)。

(2)洗涤：i将样品离心，l弃乙醇，l重新悬浮于5ml1PBS中，l离心，l弃上清液。重复此步骤2次。

(3)平衡处理(此步骤仅用于Oncor公司试剂盒)：i将样品离心后吸去上清液，l每管加入75μl平衡缓冲液，l用吸头反复吹吸数次，l室温下静置5～10min。

(4)反应：i离心，l吸去平衡缓冲液，l每管加入反应液54μl(18u11TdT酶＋36μl反应缓冲液)，l用吸头反复吹吸数次，l离心管加盖，l置37℃水浴箱内温育30min(每10min摇动离心管以悬浮细胞)。

(5)终止反应：i直接向离心管内加入5ml终止和(或)洗涤液，l继续孵育10min，l离心，l弃去上清液，l重复此步骤1次。

(6)洗涤：i向离心管内加入5ml1PBS，l重新悬浮细胞。

(7)F1TC标记：i样品离心后，l弃上清液，l每管加入100μl1FITC反应液(含亲合素FITC，l或链霉亲合素-FITC，l或抗地高辛-FITC)，l室温下避光孵育30min。

(8)洗涤：i直接向离心管内加入5ml1PBS。

(9)PI复染：i样品离心后，l吸去上清液，l每管加入0.5～lml1PI染液(根据每管细胞数目)，l反复吹吸使呈单个细胞悬浮，l室温下避光染色30min。

(10)流式细胞分析检测：iFACScan流式细胞仪，l采用波长为488nm的激发光，l检测绿色荧光(FITC，l波长530±30nm)和红色荧光(PI，l波长：i＞620nm)。