1.建立PCR反应体系见表4—5。

表4—51PCR反应体系的组成

【注：i①总体积为50μl；

②引物的计算：i50umol＝16.31ng×b(b＝引物的碱基数)；

③模板DNA量最好＞104拷贝；

④用于逆转录PCR(RT-PcR)的cDNA模板，l可通过RNA逆转录获得(参见有关专业资料)。如果同时进行多个样本的扩增，l可预先将以上前5种成分(除引物和模板外)混合制成工作液，l使用时分取】

2.先将PCR工作液加入0.51ml的薄壁Eppendorf离心管中，l然后加入模板和引物。

3.混匀，l稍离心。

4.在反应液表面涂抹20～40u1矿物油，l以防液体蒸发。

5.将反应管置于PCR仪上进行反应。常规PCR反应循环参数为：i

(1)先于95℃下变性2min。

(2)此后，l每个循环周期为①变性：i94℃，l60s；②退火：i55℃，l40s；③延伸：i72℃,160s。

(3)一般进行30～35个循环。具体循环参数依不同实验而定。

6.由PCR技术衍生和发展了多项PCR相关技术(参见有关专业资料)。