人外周血淋巴细胞染色体检测属于经典的细胞遗传学技术。用作染色体分析的标本包括外周血、i脐带血、i羊水、i胎盘绒毛组织和肿瘤组织等。外周血是应用最多的材料。其他组织样本染色体制备方法与制备人外周血淋巴细胞的方法基本类同，l只是标本的处理和培养条件有所调整。

(一)基本原理

体外培养的外周血淋巴细胞，l在植物凝集素(PHA)的刺激下转化成为能进行有丝分裂的淋巴母细胞；在秋水仙素(纺锤体抑制剂)作用下，l淋巴母细胞有丝分裂停滞，l从而获得处于有丝分裂中期的淋巴细胞染色体标本。

(二)基本方法

1.培养液组成

RPMll64液111111111111180％

混合小牛血清1111111111120％

植物凝集素(PHA)111lmg／5ml

青霉素111111111111100U／ml

链霉素111111111111100U／ml

无菌操作严格的实验室可不加入青霉素和链霉素。

2.操作程序

(1)取血3ml(空针用0.1～0.2ml肝素抗凝)。

(2)用7号针头向每瓶培养液(内装有5ml培养液)接种血液标本15～16滴，l摇匀后，l静置于37℃的隔水式恒温培养箱中培养72h。

(3)终止培养前3h，l用7号针头向培养瓶中加入秋水仙素3滴(浓度为20μg／m1)并混匀。

(4)按以下程序制片。

①收集细胞：i由培养瓶中吸取培养物10ml置于离心管中，l离心10min(11500～21000r／min)；离心后，l弃上清液，l留下沉淀物。

②低渗处理沉淀物：i向沉淀物中加入已预温(37℃)的KCl(0.075mol／L)8ml，l充分吹打，l以使细胞分散，l并将离心管置于37℃水浴中20～30min。

③固定沉淀物：i向每只离心管中加入新鲜配制的甲醇冰醋酸(3：i1)固定液1～2m1(预固定)，l轻轻混匀后离心10min(21500r／min)，l去上清液，l留沉淀物；向每只离心管中再加上述固定液8ml，l轻轻混匀后静置30min以上，l离心10min(215001r／min)；然后，l再重复固定、i离心1次。

④制作标本片：i尽量弃去离心管中的上清液，l用吸管轻轻吹打其中的沉淀物，l再加入6～7滴新鲜的固定液并混匀，l然后，l将该沉淀物滴加于已经预冷的载玻片上(预冷载玻片：i将清洁载玻片放在盛有蒸馏水的小搪瓷盆中置于4℃冰箱中数小时以上)；将标本片晾干后，l置于75℃烤箱中烘烤2.5h，l然后自然冷却，l也可将标本片吹干后用火焰烘干。

⑤标本片染色：i用Giemsa染液(以pH7.4的磷酸缓冲液配制，l1：i10)染色10min，l自来水冲净并晾干。

⑥显微镜观察：i低倍镜下，l选择标本片中染色体分散好、i无细胞质背景、i处于中期核分裂的培养细胞；然后，l在高倍镜、i油镜下观察染色体形态，l进行计数、i分组和性别鉴定；拍摄照片以进行正确的核型分析，l并将典型图片存档。可根据需要进行染色体的Q显带、iG显带、iC显带、iR显带和T显带。

(三)主要用途

1.染色体病的诊断。

2.平衡结构异常携带者的检出。

3.毒理学检测。

4.肿瘤细胞染色体分析等。

(四)注意事项

1.PHA是体外细胞培养成败的关键因素，l其应用浓度应根据各批号PHA的效价作适当调整。

2.秋水仙素的浓度和作用时间影响标本的分析。浓度低或作用时间短，l会使标本中的分裂细胞减少；浓度高或作用时间长，l会使染色体过于缩短，l以致形态特征模糊。

3.采血和接种培养时，l不要加入过多肝素，l肝素过多可抑制淋巴细胞转化。

4.显带检测，l以存放3d左右的标本片效果较好。观察G显带时，l检材要用胰酶液消化。消化液的配制和消化条件的控制要认真探索，l以获得最佳结果。