(一)基本原理

1.原位杂交是用标记了已知序列的核苷酸片段作为探针，l通过核酸杂交，l直接在组织切片(冷冻切片或石蜡切片)、i细胞涂片、i染色体制备标本或培养细胞爬片上，l检测或定位某一特定的目的DNA或目的RNA的存在。

2.FISH是以荧光素标记已知序列的核苷酸片段(探针)，l通过检测荧光来定性和定位目的核酸片段，l具有敏感、i快速、i能同时显示多种颜色等优点，l不但能显示中期核分裂象的染色体，l还能检测间期细胞核的DNA。

(1)FISH的直接法：i以荧光素直接标记DNA探针，l特异性强，l方法简便。随着荧光标记技术的改进，l直接法的敏感性不断提高，l是目前常用的方法。

(2)FISH的间接法：i以非荧光素标记物标记DNA探针，l再桥连一个荧光标记抗体。

(二)基本方法

1.染色体制备，l参见本节的“一、i”项“(二)基方法”。

2.探针和试剂。用于FISH的探针有不同类型。已有商品化的探针用于1FISH。Avidin-FITC、ianti-avidin和PI等检测试剂均可购得。

3.原位杂交。杂交前标本和探针应经变性处理。

4.检测。杂交后的标本除去封胶，l置2×SSC中洗去盖片。经多步骤漂洗后依次在亲和素一荧光素、i抗亲和素抗体和亲和素一荧光素中各孵育20min(生物素标记探针)，l其间及其后各用1×PBD洗3次，l每次2min。若用直接法FISH进行检测，l后续免疫结合反应可省略，l最后应加抗荧光衰变剂和DNA复染剂后封片。

5.进行荧光显微镜观察并摄影保存。

(三)应用

1.FISH可用于各类细胞间期核的非整倍体检测。

2.实体瘤和白血病特殊染色体畸变或位点突变分析。

3.染色体重排位点的确定以及辅助基因诊断、i基因定位和基因作图等。

(四)注意事项

1.实验室必须优化FISH操作过程的各项条件。

2.整个杂交和杂交后检测过程要始终保持标本片的湿润，l以防载玻片干燥后引起非特异性染色。

3.复染时要避光。根据荧光染料的不同选择相关的荧光显微镜滤色片。