【原理】
免疫放射分析法(immunoradiometric1assay，lIRMA)是用过量的放射核素标记抗体(*Ab)和限量的抗原或半抗原(Ag)结合，l形成Ag*Ab，l其放射性和所加Ag的量呈正相关。如以不同量的Ag标准品求出与Ag*Ab放射性的量效关系，l即可从待测样品在相同条件下测得的Ag*Ab放射性求出待测样品的量。
[Ag]＋[*Ab]←→[Ag*Ab]
抗原1过量抗体111复合物
从原理的角度讲，lIRMA的主要特点包括以下几方面：i
(1)属于非竞争性抗原抗体结合反应。
(2)抗原抗体复合物的量与所加非标记抗原的量呈正相关。
(3)因为不存在竞争结合反应，l低剂量区没有不确定因素，l因此灵敏度较高。
(4)分离步骤的主要目的是把*Ab和Ag*Ab分开。由于*Ab和Ag*Ab都含γ球蛋白，l分子量也比较接近，l很多在RIA中常用的分离方法都不能用，l需要用特异抗体作分离剂。这在很大程度上造成了IRMA在方法学上的特殊性，l即几乎全部是夹心法，l也就是一个IRMA系统中需要两个抗体，l都是针对同一个抗原的，l但是抗原决定簇不同，l一个抗体标记后作为探测抗体，l一个抗体用作分离剂。正是这一特点，l使IRMA的测定对象主要限于有两个以上抗原决定簇的肽类或蛋白质。
(5)由于Ag越小Ag*Ab放射性越低，l所以在IRMA中NSB的高低对低剂量Ag测量的准确性影响大，l如何降低NSB对灵敏度很重要。
【试剂盒】
试剂盒的基本要求和RIA试剂盒相同，l由国家批准的生产单位提供，l使用者应按说明书的要求合理使用。如果临床工作需要，l使用者可以对试剂稀释度、i操作步骤等进行适当改动，l但对改变了的方案应作精密度、i准确度、i灵敏度等考核，l并作详细记录。
一般试剂盒都包括3种主要试剂：i标记抗体、i非标记标准抗原(标准品)、i分离试剂或材料，l很多试剂盒还提供缓冲液及质量控制用的样品。
1.标记抗体标记抗体必须亲和力高、i特异性高。通常都由生产厂家精选后用125I标记，l可以是多克隆(polyclonal)，l也可以是单克隆(monoclonal)抗体。一般说首先要保证特异性，l所以多数试剂盒选用单克隆抗体。对于抗体的亲和力，l通常由生产厂家测定，l借用RIA的Scatchard作图法，l对尚未连接”5I的抗体进行鉴定，l然后向用户提供数据。为了保证标记抗体的特性与未标记前一致，l制备标记物的条件要温和，l每一抗体分子最好仅含一个125I原子。由于125I的衰变等不稳定因素，l厂家应当提供试剂盒的有效期。
2.标准品或校准试剂11标准品是定量的依据，l要求纯度尽量高，l配制时浓度应准确，l并注意保存。
3.分离试剂和材料11即固相抗体。通常也由生产厂家提供。所用抗体必须和标记抗体针对不同抗原决定簇。也可以是多克隆(polyclonal)或单克隆(monoclonal)抗体。该抗体预先牢固地吸附在某种固体支持物上，l待测抗原一个抗原决定簇和标记抗体结合，l另一个抗原决定簇和固相支持物上的非标记抗体结合，l便能和游离抗体分开。很多材料可供选用，l如塑料(聚乙烯、i聚苯乙烯、i尼龙等)、i纤维素、i凝胶颗粒(葡聚糖、i琼脂糖、i聚丙烯酰胺等)、i多孔玻璃微球、i磁性颗粒等。磁性颗粒法是将固相颗粒(如纤维素)与含铁化合物(如氧化铁)连接，l再与抗体连接，l此种颗粒在磁场吸引下不需离心即可与游离标记抗原分开。
4.质量控制样品及缓冲液等11要求和RIA相同。
【测定方法】
IRMA的测定方法一般也包括加样、i孵育、i分离结合和游离部分、i测放射性、i数据处理等5个步骤。很多方面和RIA相似，l不再一一重复。由于不是竞争结合，l当然不存在经典加样法和顺序加样法之分。但是从加样顺序及所用标记试剂的不同，l又有几种不同情况。
1.双抗体夹心法实际应用时，l有抗原先和固相抗体结合再加标记抗体的，l有同时加的，l也有先让标记抗体与抗原结合，l再加固相抗体的。由于抗原抗体的结合反应是在标记抗体过量的情况下进行，l有不少IRMA的反应允许在室温下进行，l可以缩短孵育时间，l每一具体IRMA系统的加样顺序、i孵育时间、i孵育温度、i分离条件(离心所需克数及时间、i或磁性颗粒用磁场吸引等)通常都应按照试剂盒的说明书进行。最后形成复合物固相抗体-待测抗原-125I标记抗体。
2.标记第3抗体法这种方法是将125I标记在第3个抗体上，l此时原来带标记的用作分析试剂的抗体不带标记，l而标记的第3抗体则是针对该分析抗体的，l如果分析抗体是鼠的抗体，l则第3抗体用兔(或羊或豚鼠)抗鼠的抗体。所以这种抗体具有多用性，l凡是分析抗体来自同一种动物的都可以用。第3抗体往往前两个抗体已经和抗原充分反应后再加。最后形成复合物固相抗体-待测抗原-非标记分析抗体-125I标记抗体。
3.双标记抗体法11为了进一步提高IRMA的灵敏度，l有人建立了双标记抗体法，l该法要求待测抗原有三个以上抗原决定簇，l形成至少三个不同结合位点的抗体，l其中一个作分离剂，l另两个以125I标记，l用作分析抗体。最后形成下述复合物。
125I标记抗体
固相抗体-待测抗原{
125I标记抗体
4.生物素一亲合素系统(biotin—avidin1system，lBAS)111其引入对提高灵敏度及缩短分析时间有较明显的效果。生物素可以用来标记抗体，l而且每一抗体分子可以连接几十个分子的生物素。生物素又能和125I标记的亲合素牢固结合(Ka达1014～1015L／m01)，l因此该系统本身的放大效应很明显。在IRMA中，l用生物素标记的抗体代替”5I标记的分析抗体，l充分反应后再加125I标记的亲合素，l形成复合物固相抗体-待测抗原-生物素标记抗体-125I标记亲合素使分析灵敏度明显提高。
【数据处理和质控】
IRMA的数据处理除数学模型外都和RIA相仿，l质控也和RIA相同，l此处不再重复，l仅就数学模型作一简要叙述。
早期曾认为四参数Logistic是IRMA较好的数学模型。但是四参数Logistic模型只适合对称性曲线，l而实际上IRMA的曲线是不对称的，l因此近年来已不主张应用，lLogit-Log法当然也是不合适的。目前认为可以应用的曲线拟合法有以下3种：i
1.平滑样条函数把各点直观地连起来加以平滑。待测样品以内插法求得含量。目前有的试剂盒生产厂家仍推荐这种方法。但是本法缺乏理论依据，l遇有突出值时影响大。此外，l有些试剂盒生产厂家迄今仍推荐直线化的方法，l认为在1IRMA的低剂量区域是一条直线，l如果仅使用厂家指定的区域，l可以用直线回归法。应当指出，l用这种方法近似是可以的，l但是不论是理论上或精密的实践中都可以证实，l即使是低剂量区也不是直线，l对于要求高的实验不宜采用。
2.五参数Logistic模型在四参数Logistic模型上加一不对称因子，l由计算机通过最小二乘回归求得五个参数。不对称因子即下式中的C。本法虽适用于IRMA的多数场合，l但是不对称因子是一经验参数，l并非来自质量作用定律。
Y＝（a－ｂ）／［１＋（Ｘ／ｃ］c＋ｄ1111（1）
3.三参数质量作用定律模型11函数式如下：i
R21Fb(c+q)+X]+R[c(b—1)+D—q]—c=01111111111（2）
式中各参数的含义与RIA的四参数质量模型相同。该模型已用稳健回归法编成应用软件，l经多年来多个IRMA系统的实际应用，l结果是满意的。