【原理】

酶免疫分析(enzyme1immunoassay，lEIA)的原理与RIA和IRMA相同，l不同的是用酶替代放射性核素标记抗原或抗体，l经竞争性或非竞争性免疫结合反应，l产生的免疫复合物，l其中的酶催化特定底物，l生成有色产物，l可根据有色产物的吸光度不同来对受检样品作定性或定量分析。常用的酶标记物：i

1.辣根过氧化物酶(horseradish1peroxidase，lHRP)11用于EIA的主要是1HRP的C型同工酶。HRP首先与H2O2结合形成活泼的“氧化剂”，l再催化底物氧化生成显色产物。HRP的常用底物有：i邻苯二胺(OPD)、i5-氨基水杨酸(5-ASA)、i四甲基联苯胺及其硫酸盐(TMB、iTMBS)、i邻联甲苯胺(OT)等。

2.碱性磷酸酶(alkaline1phosphatase，lAP)11AP系水解酶，l将不同的磷酸酯水解使之成为有色产物。常用底物为对硝基酚磷酸酯(p-NPP)、i酚酞单磷酸酯(phenolphthelein1monophosphate)。

【分类】

1.按免疫反应后是否分离结合抗原(B)和游离抗原(F)

(1)均相EIA：i又称酶检测免疫分析技术(enzyme1monitored1immunoassay1technique，lEMIA)。酶与半抗原结合为酶标半抗原，l与被测半抗原竞争地与抗体结合，l标记抗原与抗体结合后，l酶的活性即被抑制，l因此不需加入分离剂，l直接测定游离酶标半抗原的酶活性即可推算被测半抗原的量。EMIA主要用于小分子抗原或半抗原的定量，l如激素、i药物或毒品等的分析。

(2)异相EIA：i酶标抗原或抗体与标本中的待检抗体或抗原结合，l分离除去未结合酶标抗原或抗体后，l加入酶底物显色即可做定性或定量分析。常用固相分离法，l又称为酶联免疫吸附分析(enzyme1linked1immunosorbent1assay，lELIsA)，l与均相EIA相比，l该法应用范围较广，l可标记各种抗原和抗体。

2.根据所用固相物质不同

(1)板式ELISA：i全部反应和比色都在塑料微孔板中进行。目前国际通用8×12的96孔板。

(2)管式ELISA：i用小管作为反应容器和比色管，l反应体积大，l比色光径长，l可在一定程度上提高检测灵敏度。

(3)小珠：i一般直径为61mm，l吸附面积明显增大。

3.按抗原抗体结合方式

(1)竞争性结合酶免疫法：i标记抗原与待测抗原竞争地与抗体相结合。

(2)非竞争性结合酶免疫法：i抗原抗体之间的反应不存在竞争性。现以应用最为广泛的ELISA为例加以说明。

①直接ELISA：i酶标记抗体与待测抗原非竞争性结合，l再与固相载体形成复合物，l称双抗体夹心法，l常用于测定较大分子抗原。

②间接ELISA：i酶标记的第二抗体作为一种通用试剂，l可与任何第一抗体结合。

【试剂组成】

1.酶标抗体(抗原)111要求酶稳定不失活，l4℃可保存数月。

2.固相抗体(抗原)11聚苯乙烯微孔条，l透明度高，l吸附性能好，l材质均匀，l孔间差异小。包被抗原纯度高，l包被抗体效价高，l亲和力强，l4℃、i密封、i避光、i干燥的环境中保存，l一般可保存6个月。

3.底物11底物应稳定，l易于保存。OPD为白色粉末，l易于氧化并对光敏感，l应密封保存于棕色瓶内，l4℃干燥环境下存放，l临用前配制。而TMB配制后密封保存在棕色瓶内，l4℃可存放半年。

4.结合物和标本的稀释液11稀释液中常加入高浓度的无干扰作用的蛋白质(如101g／L1BSA或510g／L脱脂奶粉)，l一般还含有0.05％非离子表面活性剂如1Tween20，l可抑制蛋白质在塑料表面的非特异性吸附。

5.洗涤液11常用含0.05％Tween20的PBS。

6.酶反应终止液11常用21mol／L硫酸。

7.校正试剂11参见时间分辨荧光免疫分析。

8.质控血清11参见放射免疫部分。

【检测条件】

1.仪器设备专用微量加样器、i加样头、i平板震荡器、i水浴箱或孵箱、i洗板机、i酶标仪。全自动酶联免疫分析系统，l可精确控制反应条件，l结果更为可靠。

2.样品采集、i处理和储存见放射免疫部分。

【检测方法】

以CanAg公司NSE检测试剂盒为例，l其免疫反应原理为生物素一链霉亲和素参与的双抗体夹心法(生物素一链霉亲和素系统原理参见电化学发光部分)，l具体检测程序如下：i

(1)将25u1样品或标准品按顺序加入链霉亲和素包被的微孔条中。

(2)每孔加入100ul单抗工作液(含HRP标记抗NSE单抗和生物素标记抗1NSE单抗)，l形成生物素-抗体-抗原-抗体-HRP免疫复合物，l并通过生物素一链霉亲和素的特异性结合固定于微孔内壁。

(3)室温孵育11h。

(4)洗涤微孔条并在滤纸上拍打除去残留洗涤液，l重复6次，l以去除游离的或抗体。

(5)加底物应用液(包含TMB和H2O2)。震荡反应301min。

(6)加终止液，l混匀后在酶标仪上读取OD值，l按要求作数据处理，l得出结果。

【资料保存及报告要求】

参见时间分辨荧光免疫分析。

【质量控制】

见放射免疫部分。

【注意事项】

1.HRP对金属污染物很敏感(甚至不能使用金属的加样器)，l因此对试剂和试验用水的要求较高，l应用新鲜的蒸馏水或去离子水。但通过聚苯乙烯树脂得到的无离子水常影响HRP活力，l如果不使用Tween20，l作固相载体用的聚苯乙烯板也可影响HRP活力。另外，lHRP对细菌及抑菌剂如NaN。特别敏感，l因此用1NaN3防腐的标本不可用于HRP标记的一步法ELISA；试验用水中的氧、i次氯酸、i芳香族的氯碳化合物都会影响HRP的活力。此外应注意H2O2不仅是HRP的底物，l也是HRP的抑制剂，l过量的H2O2对固相HRP的抑制作用比游离HRP更明显，l因此HRP的浓度应维持在0.01％～o.03％。同时，lH2O2易挥发，l放置过久引起浓度降低，l可使OD值降低。

2.OPD可能有致癌作用，l故目前倾向用TMB代替OPD。

3.AP来源11牛的肠黏膜和大肠杆菌，l二者的最佳酶活度的pH值不同，l前者为pH110，l后者为pH18。无机磷酸盐是AP的强抑制剂，l因此试验中应避免使用1PBS液；金属络合剂如EDTA也是AP的强抑制剂，l应注意避免。

4.孵育最好在水浴中进行，lELISA板底应贴着水面，l使温度迅速平衡，l各板不可重叠，l板上应加盖防止蒸发。如在孵育箱中反应，l应将板置于湿盒中。